一种脓毒症血样中乳酸的气质联用前处理方法技术

本发明专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种脓毒症血样中乳酸的气质联用前处理方法。具体步骤为：将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，蛋白沉淀后离心，取上清液；在所得上清液中加入碱溶液，中和至ｐＨ６－７，离心取上清液；上清液通过阴离子交换柱；用去离子水充分清洗阴离子交换柱后，用乙酸洗脱阴离子交换柱，收集洗脱液；洗脱液用氮吹仪吹干，加入双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，吡啶，乙酸乙酯，密封；微波反应；控制微波功率为２００Ｗ－８００Ｗ，微波反应时间为３０ｓ－１２０ｓ。本发明专利技术节约了ＧＣ／ＭＳ前处理的时间，便于进行大量血样中乳酸的快速分析，同时也有利于在临床上开展脓毒症的营养支持治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分析化学领域，具体涉及一种脓毒症血样中乳酸的气质联用前处理方 法。
技术介绍
由感染、烧伤、创伤、缺血再灌注等引起的脓毒症在临床上非常多见，是一种病 情非常严重而且非常复杂的临床病症。脓毒症在全世界范围内发病率和死亡率都很高， 据研究脓毒症的死亡率在30%至60%之间. MMWR Morb Mortal ffkly Rep. 1990,39 31-34. Angus DC,Linde-Zwirble WT,Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. , Epidemiology of severe sepsis in the United States :analysis of incidence, outcome,and associatedcosts of care. Crit Care Med.，2001，29 :1303-1310.]。每年在美国有750，000人受到脓毒症的感染，即使在发达国 家脓毒症也有超过 35% 的死亡率. Seminars in respiratory and critical care medicine,2004, 25(6) :611-618]。脓毒症诱发的脓毒性休克(S印tic shock)和多器官功能不全综合症 (Multiple organ dysfunction syndrom，M0DS)，是当前外科危重病患者的主要死亡原因之 一 ，ANNALS OF MEDICINE 1995,27(1) :13_20.]。脓毒症已 经成为医学上的一大主要难题，尤其是重症监护室(I⑶)面临的最大难题之一，目前已经 投入了很多资源在研究和治疗这一疾病上, N Engl JMed，1999，340 :207_214]。在脓毒症发生时，机体体现高代谢状态，研究体内的营养代谢有助于脓毒症的营 养支持治疗。支持治疗需要根据病情给脓毒症病人补充高热量、高蛋白、多种氨基酸等营 养物质。支持治疗会影响到脓毒症的治疗效果。近年来，国际上对脓毒症发病机理的研究 发现，当病人处于脓毒症时，临床上机体处于复杂激烈的应激反应状态，都表现为高代谢状 态、高血流动力学状态及其他的炎性反应征象。在高代谢状态下，机体组织蛋白质发生自身 分解和对外源性营养物产生不应性，靠单纯补充外源性营养物，并不能有效阻止自身的消 耗，机体出现自噬代谢(Auto connibalism)。因此，在对脓毒症患者尤其是脓毒症危重患者 开展营养物质的支持治疗时，研究营养物质的代谢途径和代谢过程非常重要。在脓毒症发 生时，血液中乳酸的代谢情况对脓毒症的营养支持治疗能起到非常重要的指导作用。传统方法乳酸的气质联用检测中由于乳酸前处理花费的时间比较长，至少需要30 分钟，对血浆样品处理来说，衍生化反应耗时长，加上所需的血样分离时间，整个前处理时 间过长，不利于乳酸的快速检测。对于脓毒症的临床监测来说，需要找到一种快速检测血样中乳酸的方法，改进血 样中乳酸的前处理方法，对临床治疗意义重大。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。本专利技术提出的，具体步骤如下(1)将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；(2)自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，蛋白沉淀，离心，取上清液；(3)在步骤(2)的血清上清液中加入碱溶液，中和至pH为6-7，离心取上清液；(4)上清液通过阴离子交换树脂柱；(5)用去离子水充分清洗阴离子交换树脂柱后，用乙酸洗脱阴离子交换树脂柱，收 集洗脱液；(6)洗脱液用氮吹仪吹干，加入双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)、吡啶和乙 酸乙酯，密封；微波反应，控制微波功率为200W-800W，反应时间30s-120s。本专利技术中，步骤(2)中所使用的过氯酸体积比浓度为8%。本专利技术中，步骤(3)中所使用的碱溶液采用氢氧化钾(K0H)。本专利技术中，步骤(4)中所使用的阴离子交换树脂可以采用cr型树脂。本专利技术中，步骤(5)中所使用的乙酸为2mol/l。本专利技术中，为了微波更好地吸收，步骤(6)中还可以加入乙腈做微波吸收剂。本专利技术中，控制微波功率为400-450W，微波反应时间为100_120s。本专利技术的有益效果是脓毒症血样中乳酸的气质联用前处理方法可以将衍生化反 应时间从传统前处理方法的30至90分钟缩短到2分钟，节约了气质联用(GC/MS)前处理 的时间，便于进行大量血样中乳酸的快速分析，同时也有利于在临床上开展脓毒症的营养 支持治疗。附图说明图1是实施例1脓毒症血样中乳酸微波衍生化反应的GC/MS总离子流色谱图；图2是实施例1脓毒症血样中乳酸微波衍生化反应的GC/MS质谱图；图3是实施例2脓毒症血样中乳酸微波衍生化GC/MS总离子流色谱图(微波功率 200W)；其中曲线(a)为30秒钟，(b)为60秒钟，(c)为120秒钟；图4是实施例2脓毒症血样中乳酸微波衍生化GC/MS总离子流色谱图(微波功率 400W)；其中曲线(a)为30秒钟，(b)为60秒钟，(c)为120秒钟；图5是实施例2脓毒症血样中乳酸微波衍生化GC/MS总离子流色谱图(微波功率 600W)；其中曲线(a)为30秒钟，(b)为60秒钟，(c)为120秒钟；图6是实施例2脓毒症血样中乳酸微波衍生化GC/MS总离子流色谱图(微波功率 800W)；其中曲线(a)为30秒钟，(b)为60秒钟，(c)为120秒钟。具体实施例方式下面的实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是限制本专利技术的范围。实施例1脓毒症血样中乳酸微波衍生化反应(1)血样来源——脓毒症动物实验4新西兰兔饲养在可控环境下，暴露于12 12小时白天/黑夜循环，提供标准的 兔食，随意供水，动物实验前至少习惯环境一星期。动物实验开始时，动物用塞拉嗪(4mg/ kg)和氯胺酮肌肉注射麻醉后，无菌条件下在左侧颈内静脉和颈动脉分别置入PE 90聚乙 烯导管(带1cm硅橡胶头)，再分别向下放至右心房和主动脉弓，导管用肝素_生理盐水 (100U肝素/mi)灌注。为了获得肝脏来源的葡萄糖净流出量绝对值，还将测量内脏区域的 血流量。开腹后分别在肝总静脉、门静脉和一条肠系膜静脉中分别置入PE 90聚乙烯导管 (带1cm硅橡胶头)。创伤手术后进行内毒素(LPS)灌注，采用静脉输液泵控制LPS滴速， 以10ng kg"1 mirT1的速率输入，诱导兔的脓毒症-高代谢-高动力性状态。在灌注实验前，从兔颈静脉中抽取血样2ml。灌注实验进行120分钟开始每隔10 分钟从颈静脉抽取血样2ml，此时兔体内代谢达到动态平衡，同位素丰度比基本稳定，即达 到坪段丰度，分析此时同位素丰度比可以用来计算体内代谢的动力学系数。血样抽取以后，立即注入加有肝素的试管中。肝素是一种含硫酸盐的粘多糖(常 用其钠盐或钾盐)，能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白肝 素，是制备血浆时最常用的抗凝剂。1ml的全血中加0. 1 0. 2mg的肝素，血样注入试管后 需要立即轻轻旋摇，但不能太猛烈，以免导致血细胞破裂造成溶血(溶血产生的血色素可 能会给分析带来影响)。加入肝素的全血及时离心，若不及时分离，冰冻保存时会引起细胞 溶解，而阻碍血浆的分离，同时因溶血而影响血样的分析。血浆样品在-20°本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脓毒症血样中乳酸的气质联用前处理方法，其特征在于具体步骤如下：（１）将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；（２）自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，蛋白沉淀，离心，取上清液；（３）在步骤（２）的血清上清液中加入碱溶液，中和至ｐＨ为６－７，离心取上清液；（４）上清液通过阴离子交换柱；（５）用去离子水充分清洗阴离子交换柱后，用乙酸洗脱阴离子交换柱，收集洗脱液；（６）洗脱液用氮吹仪吹干，加入双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺、吡啶和乙酸乙酯，密封；微波反应，控制微波功率为２００Ｗ－８００Ｗ，微波反应时间为３０ｓ－１２０ｓ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晋芬，宋国新，胡耀铭，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]