本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。本发明专利技术所述高效价、高特异性的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述单抗效价及特异性高。本发明专利技术所述单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化，可直接应用于临床检测和基础研究，在生物学和医学研究领域中具有极高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。
技术介绍
人神经巢蛋白简称Nestin，是一个中等纤维骨架蛋白，属于第VI类中间丝蛋白，因其在中枢神经系统发育过程中的瞬时性表达而被克隆，一直被作为神经干细胞特异性的标志。随着分子生物学和基因治疗技术的飞快发展，采用神经干细胞移植治疗脊髓损伤(SCI)已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。由于国内外科研机构将主要精力放在神经干细胞的体外培养、扩增、移植方面，因此，建立神经干细胞检测体系尤为重要。抗人Nestin 单克隆抗体是对人神经干细胞进行鉴定最特异的方法，完全符合分子免疫学原理，但是，高效价、高特异性的抗人神经巢蛋白单克隆抗体目前尚未见到报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。本专利技术的整体技术构思是利用细胞融合、亚克隆及多例多种组织和细胞的特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于基础医学研究，或制成多种体外诊断试剂盒进行神经干细胞的鉴定和神经干细胞移植后的疗效评价。本专利技术所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合Nestin的活性。作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。本专利技术所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本专利技术所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本专利技术的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本专利技术人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本专利技术公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入 合适的表达载体中。最后，在适合本专利技术抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本专利技术的单克隆抗体。如上所述，本专利技术还提供了用于实施本专利技术抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。本专利技术还具体公开所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，它包括如下工艺步骤(I)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白片段(LASTPIP PTPQAPSPAV) Iml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按I :10比例混合，30秒内逐渐加入45%PEG (分子量4000)，静止90秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交肿瘤细胞待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :10000的阳性孔的上清，与体外培养的人胚神经干细胞、多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选。(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为lmg/ml。本专利技术还提供所述的单克隆抗体在制备用于鉴定神经干细胞的试剂中的用途。本专利技术的另一个目的是提供一种试剂、试剂盒或芯片，包含所述的单克隆抗体。本专利技术所取得技术进步在于所获得的抗人神经巢单克隆抗体效价高、特异性非常好，可直接标记多种示踪物，借助目前先进的检测仪器如流式细胞仪、化学发光检测仪、磁性分选仪等进行神经干细胞的阳选。本专利技术将高纯度人神经巢蛋白经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人Nesting单克隆抗体,此抗体可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为神经干细胞的检测试剂，抗人神经巢蛋白单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。 具体实施例方式本专利技术公开了一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗人神经巢蛋白单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示；或其重链可变区由SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ？ID？NO.1的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ？ID？NO.2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合Nestin的活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，
申请(专利权)人：李彬，
类型：发明
国别省市：
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