抗肿瘤蛋白P53单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞株（保藏编号为CGMCC?No.6136），以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体2C4。本发明专利技术还涉及单克隆抗体2C4在制备用于检测p53蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体2C4的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体2C4在制备用于诊断p53相关性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与p53蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p53蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗肿瘤蛋白P53的单克隆抗体及其在检测P53蛋白中的应用。
技术介绍
P53基因是一种抑癌基因，是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，分为野生型和突变型两种，其蛋白产物为定位于人类染色体17pl3. 1，由393个氨基酸组成的核内磷酸 化蛋白，其分子量为53kD，因此被称为p53蛋白(Tumor protein p53)。P53蛋白分为野生型和突变型，野生型P53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用；突变型P53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。p53基因的突变、缺失是人类肿瘤的常见事件，与肿瘤的发生、发展关系密切。目前研究认为引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能；而野生型p53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。一般认为，突变型P53的过表达与肿瘤的转移、复发及不良预后相关。p53蛋白临床意义包括(1)肝癌患者有一定比例的P53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关；(2)p53突变还可见于胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。因此目前临床上在进行肿瘤治疗之前，通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验确定肿瘤细胞中突变型P53的表达水平，起到辅助诊断的目的。IHC实验的核心为特异性结合P53的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为 CGMCC No. 6136。本专利技术还提供了一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由上述杂交瘤细胞株产生。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下(I)重组表达载体的构建根据p53基因的ORF全序列(如SEQID No. I所示)设计弓I物进行PCR扩增，基因两侧分别弓丨入限制性内切酶位点SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(如SEQ ID No. 2所示),插入表达载体pCMV6_Entry,构建p53重组表达质粒;(2)P53重组蛋白的表达与纯化以该质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的P53重组蛋白；(3)单抗的筛选与制备采用上述P53重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗P53特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为2C4，亚型鉴定为IgGl ;制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化P53单抗2C4。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光验证该单抗的灵敏度和特异性。上述单克隆抗体的特异性验证OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。将本专利技术单克隆抗体2C4与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本专利技术单克隆抗体2C4特异性结合P53蛋白，与其他蛋白无交叉反应。 本专利技术还提供了单克隆抗体2C4在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本专利技术提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体2C4 ;可检测组织细胞中突变型p53的表达状况。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断p53相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于突变型P53的表达增高与肿瘤的发生、发展关系密切，因此使用本专利技术单克隆抗体检测突变型P53的水平高低，可用于辅助诊断p53相关性肿瘤。所述p53相关性肿瘤为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为抗人TP53单克隆抗体杂交瘤细胞株2C4 ；保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称CGMCC ；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏编号CGMCCNo. 6136。附图说明图I为Western blot验证p53重组质粒在HEK293T细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染PCMV6空载体的HEK293T细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染重组质粒pCMV6-p53的HEK293T细胞裂解液，杂交所用一抗为DDK标签抗体；图2为p53重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图3为单克隆抗体2C4在9种不同细胞系中的Western blot结果；图4为免疫组化检测肺癌组织中突变型P53蛋白的表达(以2C4单抗为一抗)。具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例I抗p53单克隆抗体的制备一、p53重组表达质粒的构建以从ATCC获得的质粒BC003596 (含SEQ ID No. I所示p530RF序列)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI、MluI，以及C末端Myc-DDK标签(标签序列如SEQ IDNo. 2所示),并克隆入表达载体pCMV6-Entry,构建p53重组表达质粒。二、p53重组蛋白的表达与纯化I、转染 HEK293T 细胞 HEK293T细胞以1:3传至直径IOcm的细胞培养皿中继续培养；取7. 5ml DMEM (无血清及抗生素)培养基至50ml管中，加入300 μ IPEI MegaTranl. O混匀，然后加入75 μ g上述p53重组质粒DNA混匀并静置30分钟；分别取515 μ I上述混合液至上述各细胞培养皿中，于37°C、5%C02培养箱中继续培养。转染24小时后，每培养皿细胞添加25 μ I 2Μ 丁酸钠至终浓度5mM。2、裂解细胞转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入Iml PBS进行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4 °C离心，收集上清。3、DDK亲和层析柱纯化以孔径为O. 45 μ m,直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beads 1ml,封口后放入360度混勻器中，于4°C结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图I (图I显示p53重组质粒在HEK29本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由保藏编号为CGMCC？No.6136的杂交瘤细胞株产生。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东辉，袁克湖，陈坚，王超，陈思，袁丽，龚世妍，周春，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：