本发明专利技术涉及一种特异性针对人线粒体外膜蛋白细胞色素B5异构体B(Cytochrome?b5?type?B，CYB5B)的多克隆抗体，以及利用固化CYB5B抗体的免疫磁珠(CYB5B磁珠)从细胞中提取线粒体。具体地说，经抗原亲和层析纯化的CYB5B抗体可以特异地识别各种组织和器官中的线粒体，而几乎不与其它细胞器发生作用。纯化的CYB5B抗体与磁珠材料相结合可产生CYB5B磁珠。利用CYB5B磁珠可以从少量细胞中提取到完整的线粒体(细胞数目≥104)。本发明专利技术特别适合于从实验室培养的细胞中制备线粒体。较之传统差速离心法，本方法的富集效果提高了3-4倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学和细胞学等生物
，具体而言本专利技术涉及线粒体外膜蛋白细胞色素B5异构体B(CYB5B)、CYB5B多克隆抗体制备、CYB5B抗体与磁性材料偶联后形成免疫磁珠(CYB5B磁珠)、以及利用CYB5B磁珠纯化细胞中线粒体的方法。该方法制备出的线粒体结构完整，富集效率高，可用于生物技术的各个领域。
技术介绍
线粒体是真核生物中的一种重要细胞器，它的基本生物学功能是合成细胞所需的能量化合物，ATP。线粒体还具有许多重要生物功能，包括离子稳态维护、物质代谢和细胞凋亡等。因此,线粒体功能紊乱可以导致多种疾病,例如引起神经肌肉疾病、心血管病、糖尿病、神经退行性疾病如帕金森氏病等多种疾病。对线粒体的分析有助于我们对上述疾病的 深入研究，而从有限的生物样品中分离纯化得到一定数量的、纯度较高的线粒体是进行线粒体生化及功能研究的基础。目前公认的线粒体分离纯化技术包括以下几种离心分离纯化法，自由流电泳分离法，流式细胞分选法，和免疫磁珠分离法。离心分离纯化法是根据线粒体与其它细胞器具有不同的沉降系数和密度通过离心而将线粒体与其它细胞组分分开。使用Percoll、Necodenz或鹿糖铺设连续或不连续的密度梯度溶液，将细胞匀浆液置于介质溶液中，离心开始后，原来分布均匀的粒子发生重新分布。粒子进入到一个与它本身的密度相同的位置，此时粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。由于离心技术操作过程简单、省时，得到的线粒体纯度高，一次性可以处理大量的样品。因此，离心法在线粒体的分离纯化中得到很广泛的应用。比如大鼠的脑、肝、肌肉、心等组织的线粒体，人293T细胞、小鼠LDTK-等细胞(一般IO8以上)。但是离心法不适合小规模提取线粒体。首先，微量组织和细胞中所含的线粒体很少，在离心处理的过程中容易丢失，造成线粒体回收率显著下降。其次，由于离心体积过小，介质几乎无法形成稳定的梯度，也就无法按照梯度的层次分离线粒体。自由流电泳分离法是根据不同细胞器表面的负电荷密度各不相同，继而在电场中的电泳迁移率不同而达到线粒体的分离目的。样品通过进样口进入分离腔后，被液流所带动流向另一端；而在与液体流动方向垂直的方向上同时加有电场，所以具有不同电泳迁移率的物质将在电场中迁移不同的距离，样品被分为若干束，从而在分离腔另一端的不同出口处得到收集分离。由于自由流电泳是一个全液相分离过程，不使用任何固体支持介质，分离条件非常温和，而且一般不使用有机溶剂.因此对于线粒体细胞器等，可以得到良好的分离纯化，其生物活性也同时得到较好的保存。自由流电泳技术已成功应用于酵母和拟南介线粒体的分离。但是相对于过氧物酶体、晚期胞内体而言，线粒体电迁移能力较差，在电泳的过程中容易产生沉淀，并且由于电泳本身固有的影响因素(焦耳热，电动力学变形)夕卜，还有层流(流体力学变形)以及一些综合因素的影响(电流体力学变形等)，而且这些因素又常常相互关联，使整个过程变得极为复杂，导致在电泳后有条带扩散现象和稀释效应。因此，目前自由流电泳一般也只用于大规模样品的分离。流式细胞分选法的原理是将细胞裂解液用荧光染料偶联的抗体标记，标记后的线粒体与其它组分进入流动室，形成一连串的均匀小液滴，标记有荧光染料线粒体被激光激发后产生荧光，光学系统已测定了它们的信号，仪器给整个液流充以电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定线粒体液滴就带有电荷，而不被选定的其它组分则不带电。线粒体液滴通过高压偏转板时发生偏转，从而得到分离。已有人使用流式细胞法分离过大鼠肝脏和脾脏的线粒体。但由于线粒体远比细胞小，线粒体上带上的荧光染料也较少，使得分选时的信号较弱，回收率低，分离效果差。免疫磁珠法分离的一般步骤是将抗体与磁珠混合,磁珠是以顺磁性材料如三氧化二铁(Fe2O3)或四氧化三铁(Fe3O4)为核心，在其外表面包裹高分子材料如聚苯乙烯、乙基纤维素等，制成直径从几十纳米到几十微米的微球，通过吸附结合或化学偶联将特异性抗体结合到磁珠表面，便形成免疫磁珠。免疫磁珠上的抗体能够专一地识别含有抗原的组分，然 后使用磁铁吸附磁珠，便能够有效地将该组分与其它组分分离。然后，再利用温和洗脱液将结合于磁珠上的组分析脱下来。在处理少量样品时，相对于前三种方法，免疫磁珠法具有很好的技术优势。首先免疫磁珠法没有繁琐的多次离心步骤，避免了线粒体的损失。其次免疫磁珠是通过免疫吸附作用与线粒体结合，可以吸附具有不同密度的线粒体，避免了因为线粒体的密度差异而在梯度离心中造成的损失。迄今为止，仅有一篇文献报道使用免疫磁珠法分离线粒体(Hue-Tran Hornig-Do,Gritt Giinther,Maria Bust,Patricia Lehnartz,Andreas Bosio, Rudolf J. ffiesner. Isolation of functional pure mitochondria bysuperparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry(2009)389 :1-5)。在该文章中，作者利用直接偶联了抗线粒体外膜蛋白T0M22(22-kDa translocase of outermitochondrial membrane)的单抗的磁珠来分离线粒体。但是,这个方法仍存在较大的技术不足。首先，作者显然忽略了线粒体蛋白质具有很大程度的组织特异性。如果无法找到一个非组织特异性的线粒体蛋白质及其对应的抗体，免疫磁珠方法在线粒体制备上的应用将受到很大的限制。事实上，无论是本实验室还是其他实验室都有充分证据表明T0M22的确是一个组织特异性的线粒体蛋白质(图 6), (Mootha VK, Bunkenborg J, Olsen JV, HjerrildM, Wisniewski JR, Stahl E,Bolouri MS, Ray HN,Sihag S, Kamal M,Patterson N,LanderES, MannM. Integrated analysis of protein composition,tissue diversity, and generegulation in mouse mitochondria. Cell. 2003Nov 26 ；115 (5) :629-40)。其次，作者没有意识到线粒体外膜蛋白质的丰度高低严重地影响到免疫磁珠的效率。选择高丰度线粒体蛋白质作为抗原是一个较为重要的技术考虑。再次，作者没有系统地考察在什么规模的细胞数目水平上，免疫磁珠法能够制备高质量和产率的线粒体。因此，发展一个适合于制备线粒体的广谱性免疫磁珠技术，就必须在这三个方面有革命性的突破。
技术实现思路
为了解决以上技术难题，本专利技术的第一个目的是提供一种特异定位于线粒体外膜，在各个组织中均稳定表达且具有较高丰度和免疫原活性的抗原细胞色素B5异构体B (Cytochrome b5 type B, CYB5B)。本专利技术的第二个目的是提供一种特异识别CYB5B线粒体外膜蛋白质的多克隆抗体。本专利技术的第三个目的是提供一种在少量样品中纯化线粒体及线粒体蛋白质的方法。本专利技术的第四个目的是提供一种用于纯化细胞线粒体蛋白质的免疫学试剂(CYB5B 磁珠)。为解决技术问题所采本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多克隆抗体，其特征在于能够特异结合线粒体外膜蛋白质细胞色素B5异构体B(CYB5B)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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