抗NPT II蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了特异性识别转基因植物中抗生素类安全筛选标记NPT II(新霉素磷酸转移酶基因，neomycin phosphotransferase gene II)单克隆抗体及其制备方法和用途，目的是为免疫学方法检测天然转基因物种(玉米、水稻、棉花等)中是否存在筛选标记NPT II蛋白提供关键试剂材料。制备该抗体的抗原为由经化学合成的特征性多肽片段经半胱氨酸与KLH载体蛋白偶联后免疫小鼠，最终获得的抗体均属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。对天然转基因水稻材料的免疫印迹(Western Blotting)检测和酶联免疫吸附测定(ELISA)，该抗体具有很好的特异性，可以用于对转基因材料的定性与定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及识别转基因植物的抗生素类筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene II)的单克隆抗体制备方法以及采用两种单克隆抗体组装为ELISA检测试剂盒的方法，以及该试剂盒在水稻和棉花等转基因植物检测中的用途，属于生物检测领域。
技术介绍
随着转基因产品的不断涌现，随之而来的问题就是转基因产品的安全评价及测定。在转基因品种的培养和后期鉴定中，离不开针对转化的筛选标记和报告基因，最常用的筛选标记包括抗生素抗性类筛选标记基因和抗除草剂基因，这类抗性筛选标记基因有可能会通过基因漂移造成基因污染，对环境产生不利影响(魏伟，马克平.如何面对基因流和基因污染[J].中国农业科技导报，2002，4(4):10-15)。另外，含有该种标记基因的转基因食物有可能不会被人类的肠道系统吸收利用，还很有可能产生毒副作用。所以，为降低生物安全风险，减少对环境和生物的潜在危害，目前对转基因植物的筛选标记主要包括GUS报告基因的生物化学染色方法，NPT II基因的G418抗生素抗性筛选以及CP4EPSPS一类抗除草剂基因的抗性筛选方法，其中NPT II基因被用在众多转基因植物转化用载体的构建中，该基因的蛋白产物因此也会出现在转基因植物的植株、叶片及籽粒中。为降低此类抗生素抗性蛋白对环境和生态的不利影响，转基因植物已经逐渐向非抗生素抗性筛选过渡，比如以PMI基因编码的磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase，PMI)替代抗生素抗性，最终实现更安全的无标签(Marker-free)筛选鉴定体系。对于包含NPT II蛋白转基因植物的鉴定，通常都采用PCR的方法对植物进行检测，(Varsha et.al.,Development of a multiplex Polymerase Chain Reaction method for specific detection of Genetically Modified Cotton Events MON 531and MON 15985.International Journal of Basic and Applied Sciences，2012，Vo1：45-52),申请号为CN200410023293的专利技术专利“含NPT-II标记基因转基因水稻的快速检测”方法公开了一种利用不同G418抗生素浓度进行转基因植物筛选的方法，该方法对于生长的植物是有效的，但对于经加工的粮食制品，因为加工过程的影响，很难检测到完整的核酸分子，因此，检测转基因目的蛋白也是一种重要的方法。制备特定蛋白的夹心检测用抗体通常的方法为利用重组蛋白或选择在空间和序列组成上具有免疫原性和亲水性的抗原肽经与载体蛋白偶联后进行动物免疫。重组蛋白的方法简单易行，但因优势抗原的存在，筛选过程较为繁琐，且难以筛选到配对良好的抗体，而以多肽作为抗原时，经结构和序列分析后选择恰当区域的多肽分别合成与免疫则可提高实验的成功率，并可能制得高灵敏度的检测抗体。研究论文Development of a chemiluminometric immunosensor array for on-site monitoring of genetically modified organisms(Hye-Jee Jang,Il-Hoon Cho Hee-Soo Kim，Jin-Woo Jeon,Se-Young Hwang，Se-Hwan Paek，Sensors and Actuators B:Chemical，2011，155(2)：598–605)中提供了利用重组蛋白制备NPT II抗体的方法，并将之用于免疫传感器检测。申请号为CN201310365343专利技术专利“转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心ELISA定量检测方法”公开了以重组蛋白为免疫原，分别免疫新西兰大白兔和小鼠制备多克隆抗体及单克隆抗体，并将其组装为单抗-多抗夹心ELISA试剂盒的方法。众所周知，因多克隆抗体自身的非均一组成特征，其特异性要比单克隆抗体差，且不能连续生产，不同批次免疫动物制备的多抗易产生批间差，造成测定结果不稳定。因此，通过独特的抗原设计，制备NPT II的高特异性和高亲和力单克隆抗体是检测和鉴定带有NPT II标签转基因植物的得力工具。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种针对转基因植物中常用筛选标记NPT II基因产物NPT II蛋白的单克隆抗体杂交瘤的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供一对特异性好、亲和力高，可用于双抗夹心ELISA检测的抗NPT II单克隆抗体72450-3和72449-13，这两个抗体能特异结合NPT II重组抗原和转基因植物材料中的NPT II蛋白成分。本专利技术的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物的检测方法。解决技术问题所采用的技术手段本专利技术首先利用合成的多肽抗原制备了两株分泌抗NPT II抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：1)按照序列表中Seq ID No:1所示的NPT II蛋白的氨基酸序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择了两段在空间上互不影响、具有良好免疫原性的多肽片段进行化学合成，合成的多肽其C端具有Cys残基，可通过该Cys与载体蛋白KLH偶联，免疫Balb/c小鼠。2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆。3)以重组NPT II蛋白为抗原，应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。上述技术方案中，步骤3)中，制备重组NPT II蛋白的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。具体地，可参考《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，2009年，科学出版社)。本专利技术同时要求保护采用上述技术方案制备得到的两株杂交瘤细胞株及其抗体72450-3和72449-13。其中72450-3的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：7所示，72449-13为SEQ ID No：9和SEQ ID No：11所示。两株抗体均为鼠源IgG1亚型单克隆抗体。本专利技术从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种：1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体；2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。本专利技术用腹水法制备的抗体经Protein A/G柱亲和层析纯化得到的NPT II 单抗，用ELISA技术测定72450-3和72449-13分泌的抗体亲和常数分别为1.79×109和2.27×109。本专利技术的这两株抗体可以共同或单一地对生物样品中的NPT I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合NPT II蛋白的免疫组合物，其特征在于包含由小鼠杂交瘤细胞系72450‑3和/或72449‑13分泌的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种结合NPT II蛋白的免疫组合物，其特征在于包含由小鼠杂交瘤细胞系72450-3和/或72449-13分泌的单克隆抗体。2.权利要求1所述的两种单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原分别具有SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的氨基酸序列，该多肽经化学合成后与KLH载体蛋白偶联，用于免疫小鼠。3.权利要求1所述的72450-3单克隆抗体，其重链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5，其轻链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别为SEQ ID No：6和SEQ ID No：7。4.权利要求1所述的72449-13单克隆抗体，其重链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别为SEQ ID No：8和SEQ ID No：9，其轻链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11。5.权利要求1所述的单克隆抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹长城，刘国振，兰金苹，武鹏程，郭美岑，史佳楠，韦汉福，荣瑞娟，郝育杰，李莉云，吴琳，刘斯奇，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11