单克隆抗TK1抗体制造技术

诸多实施方案涉及能够结合人TK1的血清形式的单克隆抗体或片段以及牵涉使用此类单克隆抗体或片段的试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术实施方案总体上涉及单克隆抗TK1抗体、牵涉使用此类单克隆抗TK1抗体的试剂盒和方法。背景胸苷激酶1，即TK1(ATP：胸苷5'-磷酸转移酶，EC 2.7.1.21)，是一种参与DNA前体合成的酶。TK1的一种形式还以高水平存在于患有恶性肿瘤的人和动物的血清中。因此，已经出于监测和预后目的而在若干种不同的恶性疾病中使用血清TK1活性测量，但主要用于白血病和淋巴瘤的情况中。此外，TK1是血液中可以测定的唯一增殖标记物，而且如果可用作常规实验室检验，则有可能提供较大的临床益处[1-8]。使用放射性底物125I-dUrd(TK-REA，DiaSorin Inc)测量血清TK1活性已经有几十年，但这种放射性酶测定具有有限的用途并且仅用于恶性血液学恶性病的情况下[1,2,6]。近年来已经可利用非放射性TK1活性测定(TK测定，DiaSorin Inc.)。这是一种灵敏而又稳定的测定，并且已经在患有血液学恶性病的人和狗中提供了临床上有价值的信息，特别是用于监测治疗和预测复发[8,9]。在过去的15年间，已经可利用针对人TK1的抗体并且能够测定不同的血液学和实体肿瘤诸如乳腺癌[5,10,11]和若干种其他形式的实体和血液学肿瘤[11,12]中的TK1蛋白水平而不是TK1活性。TK1蛋白测定主要依赖于基于针对TK1的C末端部分而产生的抗TK1抗体的斑点印迹程序[3,5,10-13]。选择这种策略用于抗体产生的主要原因是C末端区域参与TK1的细胞周期调控[14-16]。它含有用于在有丝分裂期间引发TK1降解的识别序列，并且已经假定这是它可能产生抗体的暴露区域[3,8,13,20,23-25]。虽然斑点印迹测定已经被成功用于许多研究中[5,10-13]，但主要限制在于它不是临床实验室实践中的常规方法。现在有超过六种不同的抗TK1抗体制剂可商购获得，并且若干种已经显示能与重组TK1和细胞TK1反应(www.acris-antibodies.com)。然而，常规临床实践中目前没有基于抗体的血清TK1测定。难以建立灵敏而且稳定的血清TK1测定的主要原因很可能与血液中存在的复杂而又可变的TK1形式有关。近来，已经利用人TK1酶和狗TK1酶进行了若干项研究，从而表征了TK1的重组形式、细胞形式和血清形式[17]。据发现，TK1以多种寡聚复合物存在，并且重要的是，这些复合物中仅有一小部分具有酶活性。特别是患有实体肿瘤疾病的患者中的血清TK1就是这种情况。寡聚似乎与血液中发生的二硫化物交联的形成有关，但是当肿瘤细胞解体且TK1被转运至血流中时也很有可能。用还原剂进行治疗导致血清TK1复合物发生一定程度的改组[2,17]，但关于免疫测定设计的这些事实的后果迄今为止还没有得到解决。血液中的TK1蛋白的主要部分不具有酶活性的这一事实可以解释TK1酶活性测量在实体肿瘤疾病的情况下不是非常有效[18]。因此，非常需要建立能以充分的灵敏度测量血清TK1的常规体外诊断程序以供临床使用。专利技术概要一个目的是提供一种能够结合人TK1的血清形式的单克隆抗体或片段。这个目的和其他目的通过如本文中所公开的实施方案来满足。所述实施方案的一个方面涉及一种能够结合人胸苷激酶1(TK1)的血清形式的单克隆抗体或单克隆抗体的片段。所述单克隆抗体或片段对选自由以下各项组成的组的表位具有特异性：人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)；人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)中的至少一个；和人TK1的构象依赖性表位。所述实施方案的另一个方面涉及一种用于测定身体样本中的细胞和/或血清TK1物质的水平的方法。所述方法包括使所述身体样本与根据以上的单克隆抗体或片段接触。所述方法还包括检测所结合的单克隆抗体或片段的量。所述实施方案的另一个方面涉及一种用于测定身体样本中的细胞和/或血清TK1物质的水平的试剂盒。所述试剂盒包括已固定至固体载体或欲固定至所述固体载体的根据以上的第一单克隆抗体。所述试剂盒还包括根据以上的第二单克隆抗体。在这方面，所述第一单克隆抗体对第一表位具有特异性，所述第一表位选自由以下各项组成的组：人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)；人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)中的至少一个；和人TK1的构象依赖性表位。所述第二单克隆抗体对选自该组的不同的第二表位具有特异性。所述实施方案的又一个方面涉及一种用于估计受试者中肿瘤复发的可能性的方法。所述方法包括使用根据以上的方法或试剂盒来测定来自所述受试者的身体样本中的血清TK1物质的水平。所述方法还包括将所述身体样本中的所述血清TK1物质的水平与代表健康受试者群体的血清TK1物质的水平或与先前在所述受试者中测得的血清TK1物质的水平相比较。所述实施方案的另一个方面涉及一种用于测定受试者中细胞增殖的方法。所述方法包括使用根据以上的方法或试剂盒来测定来自所述受试者的身体样本中的血清TK1物质的水平。所述方法还包括基于所述身体样本中的所述血清TK1物质的水平来测定所述细胞增殖。所述实施方案的又一个方面涉及一种用于测定罹患恶性病的受试者中增殖过程反应的方法。所述方法包括使用根据以上的方法或试剂盒来测定来自所述受试者的身体样本中的血清TK1物质的水平。所述方法还包括基于所述身体样本中的所述血清TK1物质的水平来测定所述增殖过程反应。所述实施方案的另一个方面涉及一种用于测定受试者中炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平的方法。所述方法包括使用根据以上的方法或试剂盒来测定来自所述受试者的身体样本中的血清TK1物质的水平。所述方法还包括基于所述身体样本中的所述血清TK1物质的水平来测定所述炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平。所述实施方案的再一个方面涉及一种分离的肽，其由氨基酸序列GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)、NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)或NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)组成。所述实施方案的又一个方面涉及一种产生能够结合人TK1的血清形式的单克隆抗体的方法。所述方法包括利用第一肽偶联物或第二肽偶联物使非人动物免疫，所述第一肽偶联物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO:1)且与第一载体蛋白偶合的肽，所述第二肽偶联物包含所述具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO:1)且与不同于所述第一载体蛋白的第二载体蛋白偶合的肽。所述方法还包括从对所述第一肽偶联物或所述第二肽偶联物具有血液效价的所述非人动物分离脾细胞。所述方法还包括通过使所述脾细胞与骨髓瘤融合来形成杂交瘤。所述方法另外包括针对对所述第二肽偶联物的效价来筛选来自由用所述第一肽偶联物进行免疫而产生的杂交瘤的上清液，且针对对所述第一肽偶联物的效价来筛选来自由用所述第二肽偶联物进行免疫而产生的杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体或单克隆抗体的片段，其能够结合人胸苷激酶1，即TK1的血清形式，其中所述单克隆抗体或片段对选自由以下各项组成的组的表位具有特异性：所述人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)；所述人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)中的至少一个；和所述人TK1的构象依赖性表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.19 SE 1351531-71.一种单克隆抗体或单克隆抗体的片段，其能够结合人胸苷激酶1，即TK1的血清形式，其中所述单克隆抗体或片段对选自由以下各项组成的组的表位具有特异性：所述人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)；所述人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)中的至少一个；和所述人TK1的构象依赖性表位。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体或片段能够结合人重组TK1和人TK1的细胞形式。3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体或片段能够结合具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO:1)的肽。4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或片段，其可通过以下方法获得，所述方法包括：利用第一肽偶联物或第二肽偶联物使非人动物免疫，所述第一肽偶联物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARK LFAPQ(SEQ ID NO:1)且与第一载体蛋白偶合的肽，所述第二肽偶联物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLF APQ(SEQ ID NO:1)且与不同于所述第一载体蛋白的第二载体蛋白偶合的所述肽；从对所述第一肽偶联物或所述第二肽偶联物具有血液效价的所述非人动物分离脾细胞；通过使所述脾细胞与骨髓瘤融合来形成杂交瘤；针对对所述第二肽偶联物的效价来筛选来自由用所述第一肽偶联物进行免疫而产生的杂交瘤的上清液，且针对对所述第一肽偶联物的效价来筛选来自由用所述第二肽偶联物进行所述免疫而产生的杂交瘤的上清液；选择产生能够结合所述第一肽偶联物、所述第二肽偶联物和人重组TK1的单克隆抗体的杂交瘤；和从所述选定杂交瘤的上清液分离所述单克隆抗体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体或片段具有可变重链VH结构域互补决定区1，即CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:6)；VH结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:7)；VH结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:8)；可变轻链VL结构域CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:9)；VL结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:10)；和VL结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。6.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体或片段具有VH结构域CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:6)；VH结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:12)；VH结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:13)；VL结构域CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:14)；VL结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:10)；和VL结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。7.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体或片段具有VH结构域CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:15)；VH结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:16)；VH结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:17)；VL结构域CDR1，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:18)；VL结构域CDR2，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:19)；和VL结构域CDR3，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。8.一种用于测定身体样本中的细胞和/或血清TK1物质的水平的方法，其包括：使所述身体样本与根据权利要求1至7中任一项所述的单克隆抗体或片段接触；和检测所结合的单克隆抗体或片段的量。9.一种用于测定身体样本中的细胞和/或血清TK1物质的水平的试剂盒，其包括：已固定至固体载体或欲固定至所述固体载体的根据权利要求1至7中任一项所述的第一单克隆抗体；和根据权利要求1至7中任一项所述的第二单克隆抗体，其中所述第一单克隆抗体对第一表位具有特异性，所述第一表位选自由以下各项组成的组：人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)；所述人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)中的至少一个；和所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·埃里克松，
申请(专利权)人：阿洛赛尔公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE