一种抗PD-L1的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种与人PD‑L1特异结合的单克隆抗体，还提供编码该抗体的核酸序列。本发明专利技术还涉及所述PD‑L1单克隆抗体的制备方法，以及所述抗体在伴随诊断的免疫组织化学检测中的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种抗PD-L1的单克隆抗体
本专利技术属于生物医药领域，具体地，本专利技术涉及了一种与人PD-L1特异结合的单克隆抗体及其制备与用途，用途包括所述抗体作为单药一线治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的抗癌药物Keytruda的诊断、治疗、预后评估及监测的体外诊断试剂。
技术介绍
PD-L1又称细胞程序性死亡配体1，是T细胞表面细胞程序性死亡受体1(PD-1)的配体之一。PD-L1主要表达在免疫细胞和非造血细胞中，尤其是T细胞、B细胞、巨噬细胞等，许多肿瘤组织中也有PD-L1蛋白的表达。PD-L1与PD-1的结合能够向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，减低CD8+T细胞的增生，限制自身免疫，负向调节炎症反应，保护自身组织，但这也会导致免疫系统无法正常识别和杀伤肿瘤细胞，造成免疫逃逸。PD-L1/PD-1作为热门的免疫检查点分子靶标，已经开发出许多针对PD-1/PD-L1的抗体用于肿瘤的靶向治疗，包括默沙东开发的Keytruda(Pembrolizumab，帕博利珠单抗)、美施贵宝BMS公司研发的Opdivo(Nivolumab,纳武单抗)、罗氏-基因泰克共同开发的Tecentriq(Atezolizumab，阿特珠单抗)等。许多临床数据显示，PD-1/PD-L1抗体的疗效与患者PD-L1表达水平密切相关，因人而异。因此，对PD-L1表达水平及组织特异性检测成为PD-1/PD-L1靶向治疗的有效辅助手段。美国FDA早已批准多个针对药物治疗的伴随诊断检测，其中，2015年批准的PD-L1IHC22C3pharmDx就是由Dako公司开发的首个针对在非小细胞癌中检测PD-L1表达的伴随诊断方法。PD-1单抗药物开发的品种很多，中国已上市品种已经达到5个，每个抗体虽然识别的靶蛋白相同，但表位却不尽相同，因此针对每种抗体进行有效性预估时选择的伴随诊断抗体虽然可以互相借鉴，但亦存在个性差异。本专利技术的目的是通过噬菌体展示淘选(PhageDisplayPanning)技术筛选出表达量高，亲和力高，特异性良好的PD-L1单克隆抗体用于PD-1单抗应用的伴随诊断，提高药物经济性和安全性。
技术实现思路
本专利技术提供一种与人PD-L1特异性结合的单克隆抗体，与现有技术抗体相比，具有表达量更高、和/或PD-L1结合特异性。具体地，本专利技术包括以下几个方面：本专利技术第一方面涉及一种抗PD-L1单克隆抗体，或其抗原结合部分，其重链可变区VH由SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示氨基酸组成；其轻链可变区VL由SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示氨基酸组成。本专利技术第二方面涉及一种核酸分子，其编码权利要求1-9所述抗体或其抗原结合部分。本专利技术第三方面涉及重组载体，其含有权利要求9所述核酸分子。在本专利技术中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以直接通过人工合成得到。在本专利技术中，所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体或噬菌体载体。在本专利技术的实施方案中，所述噬菌体载体为pBPI-RD52,该载体以pCANTAB5E基础(购自GE公司)，其限制性酶切位点进行了调整，将NotI位点替换成SfiI位点。在本专利技术的实施方案中，所述真核表达载体为pBPIRD1。该载体是将真核表达载体pcDNA3.4(购自ThermoFisher)进行了改造，在本专利技术实施方案中，所述改造方法为插入在其下游融合了人IgG1抗体的Fc片段。在本专利技术中，在所述噬菌体载体和真核表达载体中连接VH或VL序列后即得到重组载体。本专利技术第四方面涉及重组细胞，其含有本专利技术第三方面任一项的重组载体。在本专利技术中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述重组细胞可以通过例如转化、转染等方式将上述重组载体整合到细胞内获得。在本专利技术中，所述原核细胞例如各种基因型的E.coli感受态细胞。在本专利技术中，所述真核细胞例如人、鼠等来源的哺乳动物细胞。在本专利技术的实施方案中，所述原核细胞为TG1([F′traD36proABlacIqZΔM15]supEthi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK–mK–))。在本专利技术的实施方案中，所述真核细胞为HEK293的衍生细胞系。在本专利技术实施方案中，所述293细胞是经过驯化后可在特定的培养基中生长的Expi293悬浮细胞。在本专利技术的实施方案中，所述的特定培养基是没有人或动物来源成分，不含蛋白质，不含血清，化学成分明确的培养基。本专利技术第五方面涉及与人PD-L1特异结合的单克隆抗体或其抗原结合部分，其由本专利技术第二方面任一项的核酸分子、第三方面任一项的重组载体或第四方面任一项的重组细胞制备得到。在本专利技术的实施方案中，所述PD-L1单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达量很高，并且可以特异性结合人PD-L1。在本专利技术的另一实施方案中，所述PD-L1单克隆抗体在肿瘤组织切片的免疫组化检测中特异性染色。专利技术的有益效果本专利技术获得了一个高表达、高亲和力、高效价的抗PD-L1单克隆抗体，能够用于PD-L1的免疫组织化学检测。附图说明：图1：A，真核表达载体pBPI-RD1质粒图谱；B，真核表达载体pBPI-RD52质粒图谱图2：PD-L1-Fc融合蛋白纯化SDS-PAGE图，蛋白上样量10μg，Marker上样量5μL，泳道1为蛋白Marker，泳道2为PD-L1纯化蛋白。图3：抗PD-L1抗体细胞上清SDS-PAGE图，上清上样量20μL，Marker上样量5μL，其中泳道1-4为还原样品的电泳条带，具体的，泳道1为细胞上清阴性对照，泳道1、2、3、4为筛选出的重组表达抗体，泳道5为蛋白质预染分子量标记。图4：抗PD-L1纯化抗体SDS-PAGE图，蛋白上样量2μg，Marker上样量5μL，其中泳道1-3为还原样品的电泳条带，具体的，泳道1、2、3为筛选出的高表达重组PD-L1抗体，泳道4为蛋白质预染分子量标记。图5：抗PD-L1抗体ELISA结果图，ELISA横坐标抗体浓度为μg/mL。图6：抗PD-L1抗体IHC结果图，A为对照用抗体22C3的IHC染色结果，B为A8的IHC染色结果具体实施方案下面将结合实例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但下列实例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为常规产品。实施例1：人PD-L1蛋白表达参照Uniprot数据库中登录号为Q9NZQ7的氨基酸序列和结构特征注释，以GenBank中编号为NM_014143本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的PD-L1单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特征在于其重链可变区包含VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3序列，其轻链可变区包含VL-CDR1，VL-CDR2，VL-CDR3序列，其中：/n所述VH-CDR1序列为：GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；/n所述VH-CDR2序列为：INPSSGYT(SEQ ID NO:2)；/n所述VH-CDR3序列为：ARSGWLIHGDYYFDF(SEQ ID NO:3)；/n所述VL-CDR1序列为：QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:4)；/n所述VL-CDR2序列为：WAS(SEQ ID NO:5)；/n所述VL-CDR3序列为：QQSYDIVT(SEQ ID NO:6)。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的PD-L1单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特征在于其重链可变区包含VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3序列，其轻链可变区包含VL-CDR1，VL-CDR2，VL-CDR3序列，其中：
所述VH-CDR1序列为：GYTFTSYW(SEQIDNO:1)；
所述VH-CDR2序列为：INPSSGYT(SEQIDNO:2)；
所述VH-CDR3序列为：ARSGWLIHGDYYFDF(SEQIDNO:3)；
所述VL-CDR1序列为：QSLLNSRTRKNY(SEQIDNO:4)；
所述VL-CDR2序列为：WAS(SEQIDNO:5)；
所述VL-CDR3序列为：QQSYDIVT(SEQIDNO:6)。


2.权利要求1所述的单克隆抗体，其重链可变区进一步包含骨架序列VH-FR1，VH-FR2，VH-FR3，VH-FR4，从而按以下结构形成VH序列：(VH-FR1)-(VH-CDR1)-(VH-FR2)-(VH-CDR2)-(VH-FR3)-(VH-CDR3)-(VH-FR4)。


3.权利要求2所述的单克隆抗体，其中：
所述VH-FR1序列为：QVHLQQSGAELAKPGASVKMSCKAS(SEQIDNO:7)；
所述VH-FR2序列为：IHWVKQRPGQGLEWIGY(SEQIDNO:8)；
所述VH-FR3序列为：EYNQKFMDKATLTADKSSTTAYMQL...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛童丹，武鹏程，孔双泉，曾跃，张立帆，樊敏杰，张梦思，马晓飞，尹长城，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11