本发明专利技术公开了一种可以特异性结合SARS‑CoV‑2病毒结构蛋白核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)的单克隆抗体64360‑52D1，它的制备方法以及重链和轻链可变区的6个抗原决定簇序列(CDR)，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株64360#52D1分泌，可以特异性识别SARS‑Cov‑2病毒N蛋白，而不识别SARS病毒的N蛋白，因此可以鉴别这两种相似度很高的冠状病毒。本发明专利技术还提供了以64360#52D1抗体制备特异性检测SARS‑CoV‑2病毒N蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)和免疫胶体金试纸条检测方法。制备该抗体的抗原为哺乳动物细胞表达，经热处理的SARS‑CoV‑2病毒N重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物医学领域。更具体地，本专利技术涉及一种可特异性识别SARS-CoV-2病毒的N蛋白的单克隆抗体及其在新型冠状病毒检测中的应用，本专利技术的抗体在新型冠状病毒感染的筛查，检测和预后评价中具有重要应用价值。
技术介绍
SARS-CoV-2主要通过飞沫、直接接触和被感染的物体传播，其潜伏时间为1到14天，并且也由无症状感染者传播。大多数感染者仅表现出轻度至中度的呼吸道症状，或根本不表现任何症状。只有5-10％的感染者显示出完全的严重呼吸综合征，称为冠状病毒病(COVID)-19。此外，在年轻健康的个体中，COVID-19的死亡率为0.2％，但随着年龄和合并症而增加，在80岁以上患有心脏病的人中死亡率最高。总体来看SARS-CoV-2的平均死亡率约为2％-4％左右，低于SARS-CoV的10％死亡率和MERS-CoV的35％死亡率。核酸检测是检测病毒感染的病原学“金标准”，但这种检测方式对环境、运输、操作要求较高，呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点，对感染病例检测的准确度只有30％～50％。而血清抗体检测可以作为对核酸检测很好的补充，以加快对疑似案例的筛查速度。此外，对于新冠肺炎出院患者核酸检测复阳病例，也可通过抗体检测的方式辨别。相较于核酸检测，抗原检测方便、快速和低价等优势，而相较于抗体检测，抗原检测无窗口期，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测。对于这种传染性很强的新冠病毒感染，提高检测便利程度和敏感度格外重要，而抗原检测具有目前抗体检测所不能替代的优势，预期冠状病毒感染和防治的态势将会是长期的，高敏感检测方法需求强烈，这也是实践“应检尽检，愿检尽检”策略的基础，已有诊断企业布局新冠抗原检测领域，高亲和力的配对抗体在抗原检测产品开发中尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种可特异性识别SARS-CoV-2病毒N蛋白而不识别SARS病毒N蛋白的单克隆抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种分泌上述特异性抗体的杂交瘤细胞制备方法。本专利技术的再一个目的是利用上述抗体开发基于抗原抗体结合，针对SARS-Cov-2病毒N蛋白的免疫学检测方法，包括双抗体夹心的酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法。本专利技术的第四个目的是提供一种将本抗体用于新型冠状病毒肺炎的免疫学检测方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种单克隆抗体，其组成为包括(a)轻链可变区(i)包含SEQIDNO：01所示氨基酸序列的CDR-H1区。(ii)包含SEQIDNO：02所示氨基酸序列的CDR-H2区。(iii)包含SEQIDNO：03所示氨基酸序列的CDR-H3区。(b)重链可变区(i)包含SEQIDNO：04所示氨基酸序列的CDR-L1区。(ii)包含SEQIDNO：05所示氨基酸序列的CDR-L2区。(iii)包含SEQIDNO：06所示氨基酸序列的CDR-L3区。在本专利技术的第二方面，提供了一种DNA分子编码选自下组的蛋白质:取自上述六个CDR区的抗体重链序列和抗体轻链序列及其组合。在本专利技术的第三方面，提供了含有上述编码本专利技术抗体DNA的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述DNA直接转化或转导的宿主细胞。在本专利技术的第四方面，提供了将本抗体应用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的N蛋白检测的方法，包括但不限于基于双抗体夹心原理的ELISA检测试剂盒和胶体金检测试纸条。解决技术问题所采用的技术手段本专利技术通过大规模的细胞融合和筛选得到一株分泌抗SARS-CoV-2-N抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤:1)按照公布的SARS-CoV-2病毒N蛋白编码序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择N蛋白全长区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，利用真核细胞进行分泌表达，在其C端融合有组氨酸标签便于纯化，经基因合成后克隆进表达质粒载体pcDNA3.4，转染Expi293细胞进行培养，从培养基上清中分离和纯化表达产物用作免疫原和抗体筛选。2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆。3)用于特异性识别SARS-Cov-2的N蛋白的抗体制备和筛选：2003年发生的SARS病毒引发的非典型性肺炎(俗称“非典”)与2019年底发生的SARS-Cov-2感染引起的新型冠状病毒感染的肺炎(俗称“新冠”)的病原物在核酸序列和主要结构蛋白序列组成上都具有高度相似性，这增加了研制可鉴别二种病毒蛋白抗体的研发困难，在附图1的蛋白质序列比对结果中，GenBank编号为MN908947.3的是由感染者中分离SARS-Cov-2病毒基因组序列推导的N蛋白氨基酸序列，长度为422个氨基酸，GenBank编号为AY278489.2的是2003年由SARS感染者中分离SARS-Cov病毒基因组序列推导的N蛋白氨基酸序列，二者序列一致性为90.5％，仅有少量散在的差异氨基酸，且连续差异氨基酸的长度在两个之内，按照抗原表位长度是4-7个氨基酸的一般规律，要获得可鉴别两种蛋白的抗体存在制备困难。同时，N蛋白本身是一个富含磷酸化修饰的蛋白，在实际检测前需要对血液或咽拭子样本进行热灭活，蛋白也会经历结构改变、部分基团修饰改变，本专利技术利用真核表达N蛋白获得与天然样本相似的磷酸化和糖基化修饰，并且经加热处理取得和样本处理同样的加工过程，使之更接近实际检测蛋白的状态，以此经处理的蛋白进行免疫和筛选，获得了高亲和力、高特异性和可识别热处理N蛋白的优质抗体。本专利技术从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种:1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体。2)在动物腹腔内接种64360-52D1杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。本专利技术用腹水法制备的抗体经ProteinA/G柱亲和层析纯化得到的N单抗。本专利技术的优点及有益效果本专利技术获得的杂交瘤64360-52D1分泌产生的单克隆抗体，能特异性识别SARS-CoV-2病毒N蛋白，而不识别2003年发生的SARS病毒的N蛋白，具有很高的特异性，可以区分两种病毒蛋白，按照序列同源性比较，也可以区分2004年-2005年发生的新型人类冠状病毒HCoV-HKU1和2012年引起中东呼吸综合症(MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus)的MERS-Cov的冠状病毒。另一方面，该抗体可特异识别经过60℃热灭活的SARS-CoV-2病毒N蛋白，能用于SARS-CoV-2引起的新冠肺炎的筛查和检测。附图说明:图1：SARS-Cov-2和SARS-Cov病毒N蛋白序列比较GenBan本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可特异结合SARS-Cov-2病毒N蛋白的单克隆抗体，其组成为包括：/n(a)轻链可变区/n(i)包含SEQ ID NO：01所示氨基酸序列的CDR1区。/n(ii)包含SEQ ID NO：02所示氨基酸序列的CDR2区。/n(iii)包含SEQ ID NO：03所示氨基酸序列的CDR3区。/n(b)重链可变区/n(i)包含SEQ ID NO：04所示氨基酸序列的CDR1区。/n(ii)包含SEQ ID NO：05所示氨基酸序列的CDR2区。/n(iii)包含SEQ ID NO：06所示氨基酸序列的CDR3区。/n
【技术特征摘要】
1.一种可特异结合SARS-Cov-2病毒N蛋白的单克隆抗体，其组成为包括：
(a)轻链可变区
(i)包含SEQIDNO：01所示氨基酸序列的CDR1区。
(ii)包含SEQIDNO：02所示氨基酸序列的CDR2区。
(iii)包含SEQIDNO：03所示氨基酸序列的CDR3区。
(b)重链可变区
(i)包含SEQIDNO：04所示氨基酸序列的CDR1区。
(ii)包含SEQIDNO：05所示氨基酸序列的CDR2区。
(iii)包含SEQIDNO：06所示氨基酸序列的CDR3区。
2.其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系64360-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓飞，孔双泉，张立帆，金丽珠，武雷，尹长城，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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