一种用于检测新冠病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种新冠病毒(SARS

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新冠病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒
[0001]说明书


[0002]本专利技术涉及新冠病毒的检测及诊断领域。更具体地，本专利技术涉及一种可以用于新冠病毒检测的双抗体夹心ELISA方法，在新型冠状病毒感染的筛查，检测和预后评价中具有重要应用价值。

技术介绍

[0003]新冠病毒(SARS
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CoV
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2)与引起中东呼吸综合征MERS病毒和严重急性呼吸综合征SARS病毒同属于冠状病毒的大家族。SARS
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CoV
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2有一个大小为30kb的正义、单链RNA基因组。它的核衣壳蛋白(N)是由膜蛋白(M)、包膜蛋白(E) 以及刺突蛋白(S)组成的外膜，包裹着病毒的基因组。N蛋白是由两个结构域组成的磷酸化蛋白，可与病毒RNA结合，参与RNA合成和蛋白翻译，是病毒复制过程表达拷贝最多的结构蛋白，它性质稳定的特点决定了其作为病毒抗原检测的独特优势。
[0004]截至目前，国家药品监督管理局共批准新冠病毒检测试剂15个，其中核酸检测试剂10个，抗体检测试剂5个，没有批准病毒抗原的相关检测。核酸检测是病原物检测的金标准，该方法对实验室条件、检测人员、仪器要求较高，且呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点，对感染病例检测的准确度只有30％
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50％。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的IgM或IgG抗体，IgM抗体出现较早，IgG抗体出现较晚，该方法可以作为核酸检测的有效补充。对于新冠病毒核酸检测阴性的疑似病例，可以采用抗体检测作为补充检测指标。对于新冠病毒核酸检测的疑似病例，也可以用抗体检测来协同使用。
[0005]相较于核酸检测，抗原检测方便、快速和低价等优势，而相较于抗体检测，抗原检测无窗口期，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测。对于这种传染性很强的新冠病毒感染，提高检测便利程度和敏感度格外重要，而抗原检测具有目前抗体检测所不能替代的优势，预期冠状病毒感染和防治的态势将会是长期的，高敏感检测方法需求强烈，高亲和力的配对抗体在抗原检测产品开发中尤为重要。新冠病毒的N蛋白长度为422个氨基酸，由序列比对可知，该蛋白与SARS冠状病毒株号为GD01的N蛋白序列(Genbank ID为AAP51234)一致性达到了90.5％，通常制备的抗体难以将二者进行区分，这增加了抗体制备的难度。双抗体夹心ELISA 方法无论是采用传统的双抗体酶联吸附免疫法、酶促化学免疫发光法或免疫胶体金试纸条法，都需要通过特异的抗体完成检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是提供一对可配对的特异性识别SARS
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CoV
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2病毒N蛋白而不识别SARS病毒N蛋白的单克隆抗体对。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供上述特异性抗体对的制备及筛选方法。
[0008]本专利技术的再一个目的是提供一种检测SARS
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Cov
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2病毒N蛋白的双抗体夹心 ELISA
方法及试剂盒。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供了一对单克隆抗体，分别为包被抗体和检测抗体包被抗体组成为包括：
[0010](a)轻链可变区
[0011](i)包含SEQ ID NO：01所示氨基酸序列的CDR
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H1区。
[0012](ii)包含SEQ ID NO：02所示氨基酸序列的CDR
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H2区。
[0013](iii)包含SEQ ID NO：03所示氨基酸序列的CDR
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H3区。
[0014](b)重链可变区
[0015](i)包含SEQ ID NO：04所示氨基酸序列的CDR
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L1区。
[0016](ii)包含SEQ ID NO：05所示氨基酸序列的CDR
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L2区。
[0017](iii)包含SEQ ID NO：06所示氨基酸序列的CDR
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L3区。
[0018]检测抗体组成为包括：
[0019](a)轻链可变区
[0020](i)包含SEQ ID NO：07所示氨基酸序列的CDR
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H1区。
[0021](ii)包含SEQ ID NO：08所示氨基酸序列的CDR
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H2区。
[0022](iii)包含SEQ ID NO：09所示氨基酸序列的CDR
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H3区。
[0023](b)重链可变区
[0024](i)包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CDR
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L1区。
[0025](ii)包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR
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L2区。
[0026](iii)包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的CDR
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L3区。
[0027]在本专利技术的第二方面，提供了一对可以用于新冠病毒检测的双抗体夹心ELISA 方法的可配对的单克隆抗体对，配对抗体是由如下方法制备筛选获得的：
[0028]免疫原制备:真核表达及原核表达N蛋白，纯化后60℃处理30分钟，与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂混合，制备免疫原，交叉免疫小鼠；
[0029]阳性杂交瘤细胞制备:取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，以真核表达且热处理后SARS
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CoV
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2病毒N蛋白为阳性抗原正筛选，真核表达且经过热处理的SARS病毒N蛋白为阴性抗原负筛选间接ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；
[0030]单克隆抗体:阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得22株单克隆抗体，对所述22株单克隆抗体进行HRP标记和生物素标记；
[0031]夹心抗体配对:对所述22株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用于检测新冠病毒的双抗夹心ELISA方法的包被抗体、酶标抗体。
[0032]在本专利技术的第三方面，提供一种基于所述单克隆抗体对的用于检测新冠病毒的双抗夹心ELISA方法的建立包括:
[0033]所述配对的包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度、最适包被条件最适封闭剂、最适封闭条件、酶标二抗稀释液组分、酶标抗体最适作用时间、底物作用时间及双抗夹心ELISA方法临界值的确定，选取最适参数的组合，即可。
[0034]优选地，包被抗体为64360A#4:27，包被浓度为5μg/mL
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1μg/mL，最适包被浓度为 1μg/mL。
[0035]优选地，检测抗体64360A#5:42为经过辣根过氧化物酶或生物素标记的，辣根过氧
化物酶(HRP)标记后的稀释比例为1:5000至1:20000，优选1:10000稀释，生物素标记后的稀释比例为1:5000至1:20000，优选1:5000稀释。
[0036]优选地，ELISA试剂盒最低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一对适用于新冠病毒N蛋白检测的ELISA试剂盒制备的单克隆抗体，其特征在于通过如下方法获得：免疫原制备：原核表达和真核表达的SARS
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CoV
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2病毒N蛋白纯化并经过60℃热处理30分钟与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂混合，制备免疫原，交叉免疫小鼠；阳性杂交瘤细胞制备:取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，以真核表达且热处理后SARS
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CoV
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2病毒N蛋白为阳性抗原正筛选，真核表达且经过热处理的SARS病毒N蛋白为阴性抗原负筛选间接ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；单克隆抗体:阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得22株单克隆抗体，对所述22株单克隆抗体进行生物素标记；夹心抗体配对:对所述22株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对筛选，即得适用于检测新冠病毒的双抗体夹心ELISA方法的包被抗体64360A#4:27、酶标抗体64360A#5:42。2.权利要求1所述的包被抗体64360A#4:27，其组成为包括：(a)轻链可变区(i)包含SEQ ID NO：01所示氨基酸序列的CDR1区。(ii)包含SEQ ID NO：02所示氨基酸序列的CDR2区。(iii)包含SEQ ID NO：03所示氨基酸序列的CDR3区。(b)重链可变区(i)包含SEQ ID NO：04所示氨基酸序列的CDR1区。(ii)包含SEQ ID NO：05所示氨基酸序列的CDR2区。(iii...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓飞，武鹏程，武雷，孔双泉，金丽珠，尹长城，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：