筛选结合抑制剂和/或结合区域的方法技术

本申请为筛选结合抑制剂和/或结合区域的方法，涉及一种高通量筛选抑制SARS

【技术实现步骤摘要】
筛选结合抑制剂和/或结合区域的方法


[0001]本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种筛选抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂的方法。

技术介绍

[0002]新冠病毒SARS-COV-2具有高传染性，其外壳中的刺突糖蛋白(S-蛋白)能和宿主细胞表面的ACE2高亲和力结合，随后将携带的RNA注入细胞而使个体致病，由此可知，抑制SARS-COV-2和ACE结合，能够降低和消除病毒的致病性和感染性。
[0003]在筛选蛋白相互作用的抑制剂时，通常使用荧光激活细胞分选(FACS)和酶联免疫技术(ELISA)的方法。FACS单个细胞过柱，通量很低。ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长。需要经过多次洗板，加样，显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物筛选样品多的难题；3)包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差，不稳定。
[0004]因此，需要生化水平直接筛选SARS-CoV-2的RBD和ACE-2结合的抑制剂的新方法。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种高通量筛选抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂的方法和高通量筛选特异性结合SARS-COV-2的RBD的结合区域的方法，还涉及根据所述方法得到的抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂和特异性结合SARS-COV-2的RBD的结合区域。本申请所述的方法，具有以下至少一个优点：(1)实现了生化水平上筛选抑制剂和/或结合区域，无需构建细胞实验，直接快捷；(2)大大节省了试验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；(3)极大地提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔或FACS单个细胞过柱，提高到384孔，甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；(4)结果可靠：均相检测，抗原蛋白在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性；(5)信号稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而ELISA的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果。
[0006]一方面，本申请提供了一种高通量筛选抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂的方法，其包括以下的步骤：a)获得带有第一标签的第一结合区域，以及带有第二标签的第二结合区域，其中，所述第一标签和所述第二标签分别对应地包含选自下组的标签：供体标签和受体标签，其中所述供体标签和所述受体标签相互作用时，所述受体标签可获得转移自所述供体标签的能量而产生荧光；b)获得带有第三标签的第三蛋白质，以及带有第四标签的第四蛋白质，其中所述第三蛋白质和所述第四蛋白质任意地分别选自下组：SARS-COV-2的RBD和ACE-2，其中，所述第三标签可以与所述第一结合区域特异性结合，所述第四标签可以与所述第二结合区域特异性结合；c)将候选的所述抑制剂与所述带有第一标签的
第一结合区域、所述带有第二标签的第二结合区域、所述带有第三标签的第三蛋白质以及所述带有第四标签的第四蛋白质混合；d)检测所述混合后所述受体标签和所述供体标签的荧光的波长处吸光度的比值。
[0007]在某些实施方式中，所述第三蛋白质为SARS-COV-2的RBD，且所述第四蛋白质为ACE-2；或者，所述第三蛋白质为ACE-2，且所述第四蛋白质为SARS-COV-2的RBD。
[0008]在某些实施方式中，所述SARS-COV-2的RBD的浓度为约3-120nM。
[0009]在某些实施方式中，所述SARS-COV-2的RBD的浓度为约5-60nM。
[0010]在某些实施方式中，所述ACE-2的浓度为约1-60nM。
[0011]在某些实施方式中，所述ACE-2的浓度为约2-30nM。
[0012]在某些实施方式中，所述第一标签为所述供体标签，且所述第二标签为所述受体标签；或者，所述第一标签为所述受体标签，且所述第二标签为所述供体标签。
[0013]在某些实施方式中，所述供体标签包括镧系金属或其化合物。
[0014]在某些实施方式中，所述供体标签包括铕或其化合物，和/或铽或其化合物。
[0015]在某些实施方式中，所述受体标签选自下组：罗丹明、花青苷、芳酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硝基苯并恶二唑和/或荧光蛋白。
[0016]在某些实施方式中，所述第三标签或第四标签为哺乳动物的IgG Fc，其中所述哺乳动物选自下组：小鼠、大鼠、兔、猴和人。
[0017]在某些实施方式中，所述第一结合区域或所述第二结合区域为哺乳动物的IgG Fc抗体，其中所述哺乳动物选自下组：小鼠、大鼠、兔、猴和人。
[0018]在某些实施方式中，所述第三标签或第四标签为选自下组的选择标记：His、GST、Flag、Cmyc和MBP。
[0019]在某些实施方式中，所述第一结合区域或所述第二结合区域特异性结合所述选择标记。
[0020]在某些实施方式中，所述第一结合区域的浓度为0.05-2μg/mL。
[0021]在某些实施方式中，所述第二结合区域的浓度为0.5-20μg/mL。
[0022]在某些实施方式中，所述供体标签的荧光波长为620nm。
[0023]在某些实施方式中，所述受体标签的荧光波长为665nm。
[0024]在某些实施方式中，候选的所述抑制剂包括小分子化合物，和/或抗体或其抗原结合片段。
[0025]在某些实施方式中，所述SARS-COV-2的RBD包括SARS-COV-2的RBD和/或其突变体。
[0026]在某些实施方式中，所述ACE-2包括人ACE-2和/或其功能性片段。
[0027]在某些实施方式中，所述高通量为至少96。
[0028]另一方面，本申请提供了通过本申请所述高通量筛选抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂的方法获得的抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂。
[0029]在某些实施方式中，所述的抑制剂包括小分子化合物，和/或抗体或其抗原结合片段。
[0030]在某些实施方式中，所述的抑制剂包括特异性结合SARS-COV-2的RBD的抗体或其抗原结合部分。
[0031]在某些实施方式中，所述的抑制剂包括特异性结合ACE-2的抗体或其抗原结合部
分。
[0032]另一方面，本申请提供了一种高通量筛选特异性结合SARS-COV-2的RBD的结合区域的方法，其包括以下的步骤：a)获得带有第一标签的第一结合区域，以及带有第二标签的第二结合区域，其中，所述第一标签和所述第二标签分别对应地包含选自下组的标签：供体标签和受体标签，其中所述供体标签和所述受体标签相互作用时，所述受体标签可获得转移自所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选抑制SARS-COV-2的RBD与ACE-2结合的抑制剂的方法，其包括以下的步骤：a)获得带有第一标签的第一结合区域，以及带有第二标签的第二结合区域，其中，所述第一标签和所述第二标签分别对应地包含选自下组的标签：供体标签和受体标签，其中所述供体标签和所述受体标签相互作用时，所述受体标签可获得转移自所述供体标签的能量而产生荧光；b)获得带有第三标签的第三蛋白质，以及带有第四标签的第四蛋白质，其中所述第三蛋白质和所述第四蛋白质任意地分别选自下组：SARS-COV-2的RBD和ACE-2，其中，所述第三标签可以与所述第一结合区域特异性结合，所述第四标签可以与所述第二结合区域特异性结合；c)将候选的所述抑制剂与所述带有第一标签的第一结合区域、所述带有第二标签的第二结合区域、所述带有第三标签的第三蛋白质以及所述带有第四标签的第四蛋白质混合；d)检测所述混合后所述受体标签和所述供体标签的荧光的波长处吸光度的比值。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三蛋白质为SARS-COV-2的RBD，且所述第四蛋白质为ACE-2；或者，所述第三蛋白质为ACE-2，且所述第四蛋白质为SARS-COV-2的RBD。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述SARS-COV-2的RBD的浓度为约3-120nM。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述SARS-COV-2的RBD的浓度为约5-60nM。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓昱，朱婷婷，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：