一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体及其应用。本发明专利技术利用纳米抗体文库，以2019新型冠状病毒的Spike S1+S2 ECD为靶点，筛选获得一种针对2019新型冠状病毒的纳米抗体，经ELISA检测，不仅能够特异性识别2019新型冠状病毒的Spike S1+S2 ECD靶点，还同时能够识别Spike RBD靶点，且结合信号较强。将相应抗体序列构建至原核表达载体中进行表达纯化，成功表达出目标抗体，纯化后纯度大于90％；且经VHH抗体ELISA检测发现，纯化后的纳米抗体对两种靶点均具有较高的亲和力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体及其应用
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体及其应用。
技术介绍
2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是一类呈球形、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，病毒基因为连续线性单链RNA，直径在75-160nm。国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)发表声明，正式将2019新型冠状病毒(2019-nCoV)更名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)。国务院联防联控机制发布会上表示，新型冠状病毒感染的肺炎统一称谓为新型冠状病毒肺炎，简称新冠肺炎(Novelcoronaviruspneumonia，NCP)。世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)宣布，将新型冠状病毒肺炎命名为“COVID-19”：其中字母CO代表“冠状”(corona)，字母VI代表“病毒”(virus)，字母D代表“疾病”(disease)，数字19代表该疾病发现时间为2019年。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。2019-新型冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(spikeprotein)、包膜蛋白(Envelopeprotein)、膜蛋白(Membraneprotein)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid)。S蛋白(棘突蛋白，spikeprotein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(receptorbindingdomain，RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S1亚基可进一步分成两个相对独立的区域(domain)，分别是N-端区域(N-terminaldomain，NTD)和C-端区域(C-terminaldomain，CTD)。S1包含有受体结合域(receptorbindingdomain，RBD)，大部分的冠状病毒S蛋白的RBD都位于CTD，例如SARS-CoV和MERS-CoV等。只有少部分β冠状病毒的RBD位于NTD(通常NTD结合糖类受体，CTD结合蛋白类受体)。S2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：一个内在的膜融合肽(fusionpeptide，FP)，两个7肽重复序列(heptadrepeat，HR)、一个跨膜临近区(juxamembraindomain，JMD)和一个跨膜结构域(transmembranedomain，TMD)，以及C末端的胞浆区域(cytoplasmicdomain，CD)。S蛋白是宿主中和抗体的重要作用位点。S蛋白是疫苗设计的关键靶点：所有冠状病毒都具有保守的功能motif，分别位于S1(RBD序列具有高度保守性)和S2(S2比S1区域氨基酸序列更为保守)结构域，对RBD及S2区的研究，有助于设计病毒疫苗和开发新的抗冠状病毒药物。纳米抗体又称为单域重链抗体(Nanobody，VHH)是一种特殊的重链抗体的可变区，是一种优秀阻断剂的潜力。纳米抗体首次发现存在于骆驼血液，羊驼、鲨鱼等动物体内也存在。由于纳米抗体与单克隆抗体等抗体的结合方式与结合位点不同，因此在一些特殊的靶点中与抗原的结合要优于单克隆抗体。纳米抗体可以使用原核细胞等表达系统进行表达，可以极大的降低抗体的生产成本。可以对纳米抗体进行基因编辑、对纳米抗体进行修饰，达到更好地效果。纳米抗体不容易引起机体的免疫反应，可以很好的作为抗体应用进行应用。特异性的纳米抗体是通过筛选纳米抗体的噬菌体库来获取的。纳米抗体的噬菌体文库分为免疫库和非免疫库。免疫库是使用蛋白免疫羊驼、骆驼等动物制备的。非免疫库是根据纳米抗体的恒定区与可变区的结构，保留一定的恒定区对可变区进行随机编辑制备的。当纳米抗体库的库容达到107以上时，就可以获取到针对抗原的特异性纳米抗体。非免疫库的使用节约了时间，避免了免疫动物以及采集动物血液对动物造成的伤害。目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2在全球范围内迅速传播，危及全球人民的生命安全，扰乱了全球经济。因此，针对新型冠状病毒SARS-CoV-2开展抗体的研发工作迫在眉睫。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体的表达cassette序列的氨基酸序列见SEQIDNO.2所示。进一步地，所述纳米抗体的表达cassette序列的核苷酸序列见SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种含有上述的核苷酸序列的载体。进一步地，所述载体为原核表达载体。本专利技术还提供了一种如上述的基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体的制备方法，包括：将编码所述纳米抗体的核苷酸序列插入pET28a-SUMO表达载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，获得表达载体；将表达载体转化至E.coliBL21(DE3)菌株，挑取单克隆进行扩大培养；诱导表达后，破胞收集纯化抗体蛋白。进一步地，所述pET28a-SUMO表达载体SUMO的N端添加了6×Histag。本专利技术还提供了如上述的基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体在制备治疗和/或诊断SARS-CoV-2新型冠状病毒感染的试剂中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术以新冠病毒上的结构SpikeS1+S2ECD蛋白为靶点，筛选纳米抗体预制文库，在噬菌体水平获得纳米抗体。由于其中SpikeS1+S2ECD蛋白包含SpikeRBD蛋白。因此，结合于其中一个靶点的纳米抗体也可能结合于另一个靶点SpikeRBD。这两种靶点不但大小不一，位置有所区别，而且所使用的表达系统不同，充分的说明了纳米抗体对2019新型冠状病毒的结合力。本专利技术筛选出的针对2019新型冠状病毒的纳米抗体，经ELISA检测，不仅能够特异性识别2019新型冠状病毒的SPIKES1+S2ECD靶点，还同时能够识别SpikeRBD靶点，且结合信号较强。将相应抗体序列构建至原核表达载体中进行表达纯化，成功表达出目标抗体，纯化后纯度大于90％；且经VHH(VHH是纳米抗体的英文简写)抗体ELISA检测发现，纯化后的纳米抗体对两种靶点均具有较高的亲和力。专利技术人还进行实验证明：使用假病毒证明纳米抗体阻断2019新型冠状病毒感染细胞，证明具有结合2019新型冠状病毒的能力，并有阻止2019新型冠状病毒感染细胞的能力；使用金斯瑞试剂盒SARS-CoV-2SurrogateVirusNeutralizationTestKit验证纳米抗体具有中和病毒的能力。...

【技术保护点】
1.一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的表达cassette序列的氨基酸序列见SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的表达cassette序列的氨基酸序列见SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的一种基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的表达cassette序列的核苷酸序列见SEQIDNO.1所示。


3.一种含有权利要求2中所述的核苷酸序列的载体。


4.根据权利要求3所述的一种载体，其特征在于：所述载体为原核表达载体。


5.一种如权利要求1或2所述的基于新型冠状病毒S蛋白的纳米抗体的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创夫，吴鹏，肖陈诚，王勇，王震，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65