一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗SARS‑COV‑2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。一种抗SARS‑COV‑2病毒N蛋白的纳米抗体，其包含有由SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2以及SEQ ID NO：3所示的CDR3；本发明专利技术提供了一种抗SARS‑COV‑2病毒N蛋白的纳米抗体，重组表达的新型冠状病毒N蛋白筛选噬菌体展示纳米抗体库，筛选出来特异性结合N蛋白的纳米抗体，该抗体与人源Fc蛋白融合表达后，仍保持对抗原的识别能力，该抗体与Fc蛋白融合表达后，可以用作新冠抗体检测试剂盒的质控抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
冠状病毒隶属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类单链正义RNA病毒；自1937年发现首个病毒至今，共鉴定多种冠状病毒，分属于α、β、γ和δ属，其中有7种冠状病毒能感染人，分别为α属的HCoV-229E、HCoV-NL63和β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及2019年底鉴定的新型冠状病毒SARS-CoV-2。SARS-CoV-2的基因组与2003年导致SARS流行的冠状病毒基因组相似。对SARS-CoV-2蛋白的理解，大部分是基于前期对SARS的研究结果；SARS-CoV的蛋白质由两种多聚蛋白组成：ORF1a和ORF1ab蛋白质水解后形成16非结构蛋白，四种结构蛋白：突刺蛋白(S)，包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)，以及八种辅助蛋白：ORF3a，ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a，ORF8b和ORF9b。虽然被认为是辅助蛋白对病毒复制来说不是必须的，但在病毒与宿主的相互作用起重要作用。冠状病毒的核衣壳蛋白是一种在感染过程中大量表达的结构蛋白，病毒感染细胞后，N蛋白与RNA一起进入细胞，参与病毒的复制、组装和释放；SARS-CoVN蛋白含有两个RNA结合结构域构成，分别是N端的NTD和C端的CTD，中间由富含丝氨酸和精氨酸的结构域连接；新型冠状病毒抗原N蛋白具有较强的免疫原性，是新冠抗体检测试剂盒和抗原检测试剂盒的重要检测靶标，从而开发一种高灵敏度的新冠抗原检测的方法及用到的质控抗体十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中需要进一步提高高灵敏度检测新冠抗原以及开发其用到的质控抗体的问题，而提出的一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其包含有由SEQIDNO:1所示的CDR1、SEQIDNO:2所示的CDR2以及SEQIDNO：3所示的CDR3。一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。一种编码如权利要求1所述的纳米抗体基因。一种如权利要求1所述的纳米抗体制备方法。优选的，主要包括以下步骤：S1、纳米抗体库的构建；S2、拯救噬菌体表面展示纳米抗体库；S3、淘选纳米抗体；S4、淘选识别目的蛋白的纳米抗体；S5、挑选识N蛋白的阳性克隆。一种重组构建体，采用权利要求1所述的纳米抗体与Fc蛋白融合表达。一种如权利要求7所述的重组构建体制备方法，包括以下步骤，第一步，用引物扩增权利要求1所述的纳米抗体基因；第二步，将扩增后的纳米抗体基因，经sfiI和NotI双酶切，插入抗体表达载体pSecTag2A-fc；第三步，用质粒抽提试剂盒提取质粒；第四步，融合蛋白的表达。一种如权利要求1所述的纳米抗体在检测新冠抗体检测试剂盒、经胶体金试剂盒的应用。与现有技术相比，本专利技术提供了一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，具备以下有益效果：1、本专利技术提供了一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，重组表达的新型冠状病毒N蛋白筛选噬菌体展示纳米抗体库，筛选出来特异性结合N蛋白的纳米抗体，该抗体与人源Fc蛋白融合表达后，仍保持对抗原的识别能力，该抗体与Fc蛋白融合表达后，可以用作新冠抗体检测试剂盒的质控抗体，用ELISA方法测得该抗体与N蛋白结合的EC50为2.15ng/ml；该抗体也可以继续改造，提供抗体的亲和力，直接用于开发高灵敏度的新冠抗原检测试剂盒，该抗体可以用于新冠抗体检测试剂盒调试，经胶体金试剂盒检测抗体特异性良好，检测的抗体浓度低至62.5ng/ml。附图说明图1为本专利技术的纳米抗体与N蛋白结合检测结果图；图2为本专利技术的胶体金检测结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体制备方法具体如下：1.纳米抗体库的构建1.1、取一支15ml离心管，先加入与血液样本等量的分离液，小心吸取血液样本加于分离液之液面上，450-650g，离心20-30min；离心后，此时离心管中由上至下分为四层，依次为血浆层，环状乳白色淋巴细胞层，透明分离液层和红细胞层；用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中；向所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞，250g，离心10min；离完心看上清液是否澄清，不够澄清加长离心时间；用1xPBS清洗细胞2次，加trizol裂解细胞-80℃保存。1.2、取-80℃保存的外周淋巴细胞裂解液在室温中融化；加入0.2ml氯仿，盖上盖子，剧烈振荡15s，室温放置2min后，于12000g、4℃离心15min；将上清小心转至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；于12000g，4℃离心15min；离心后弃上清，沉淀用75％的酒精漂洗，再次于12000g，4℃离心5min；离心后弃上清，将离心管置于室温，待其干燥用无RNase的水溶解RNA；取少许溶解的RNA跑琼脂糖胶，并测定浓度，判断RNA是否降解。1.3、从-80℃取出总RNA于冰上融化；PCR仪上65℃5min打开RNA的二级结构；依次加入buffer和逆转录酶及引物37℃30min，98℃5min；用内参引物验证得到的cDNA；-20℃保存，长期保存需要-80℃；配制PCR反应体系，用羊驼抗体库引物，从cDNA中扩增出抗体基因；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下约500bp左右的目的条带，用胶回收柱回收目的片段扩增产物；用SfiⅠ和NotⅠ双酶切pCANTAB5E载体和抗体基因；1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制反应体系，将抗体基因连入酶切后的pCANTAB5E载体；按下列体系配制连接体系：载体1.5ug，抗体0.5ug，T4连接酶2μL，10xbuffer10μL，加水至100μL，在PCR仪上16℃连接过夜。1.4、TG1划线接种到Minimal培养板37℃培养过夜；接种TG1单菌落至5mL2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4-0.5；将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其特征在于，其包含有由SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2以及SEQ ID NO：3所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其特征在于，其包含有由SEQIDNO:1所示的CDR1、SEQIDNO:2所示的CDR2以及SEQIDNO：3所示的CDR3。


2.一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。


3.一种抗SARS-COV-2病毒N蛋白的纳米抗体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。


4.一种编码如权利要求1所述的纳米抗体基因。


5.一种如权利要求1所述的纳米抗体制备方法。


6.根据权利要求5所述的纳米抗体制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
S1、纳米抗体库的构建；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗绍祥，高霞，杨洁，张芳，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42