本发明专利技术涉及一种抗新型冠状病毒SARS‑Cov‑2的中和性单域抗体及其应用。该抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3之一。该抗体可用于制备针对COVID‑19的诊断试剂或诊断试剂盒、抗体药物或药物组合物。本发明专利技术通过噬菌体展示技术获得了SARS‑CoV‑2特异性全人源单克隆单域抗体，具有SARS‑Cov‑2伪病毒中和作用，且与IgG型SARS‑CoV‑2中和性抗体4A3联合使用对D614G突变株伪病毒具有协同中和效应；这为COVID‑19的预防和治疗提供了有效的备选抗体药物。
【技术实现步骤摘要】
一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
本专利技术涉及一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用，属于生物医药
技术介绍
2019年年底爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由一种新型冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)感染所引起的急性呼吸道类传染病[1]。SARS-CoV-2为直径约80-120nm的正链单股RNA病毒，为β属冠状病毒[2]，与SARS-CoV病毒结构极为相似，基因组同源性高达79.5％[3]。研究证实，SARS-Cov-2与SARS-CoV宿主受体均为血管紧张素转换酶2(ACE2)[3]。ACE2是一种羧肽酶，也是一种蛋白质受体，主要在肺泡细胞和肠上皮细胞中表达[4]。SARS-CoV-2通过病毒外壳上spike蛋白S1亚基的受体识别结构域(receptorbindingdomain,RBD)与ACE2结合，诱发S2亚基结构的改变，进而促进病毒与宿主细胞膜的融合，介导病毒入侵宿主细胞[5]。目前SARS-CoV-2的S蛋白RBD与人受体蛋白ACE2复合物晶体结构已被解析，相互作用位点亦被准确测定[6]。因此，以SARS-CoV-2的S蛋白RBD作为抗原，筛选获得阻断SARS-CoV-2与ACE-2相互作用的中和性抗体，是干预新型冠状病毒感染的可行的预防和治疗手段[7]。SARS-CoV-2以其遗传多样性和重组频繁的特点不断产生变异体。目前全球已公开72109条SARS-CoV-2全基因组序列(https://bigd.big.ac.cn/ncov/)，基因组变异13764个，在spike蛋白共有1710个位点发生突变，引起氨基酸变化的突变共906个，位于RBD的氨基酸111个。其中，spike蛋白第614位天冬氨酸(D)→甘氨酸(G)为主要突变类型，目前该突变株全基因组序列26310条，占比约36.5％，已迅速成为全球大流行中主导形式。G614病毒与D614相比具有明显更高的感染性滴度，增加约2.6至9.3倍[8]。但是由于单点突变造成的SARS-CoV-2的S蛋白的结构变化有限，因此获得针对变异病毒的中和性抗体难度较大。单域抗体为仅含有抗体重链可变区的抗体片段，具有分子量小、蛋白表达水平较高、免疫原性弱、易于生产制备等优势[9]。单域抗体能够更好地靶向抗原表面隐蔽的精细结构，对抗原的微小结构改变具有更加灵敏的识别能力[10]，因此筛选靶向SARS-CoV-2的RBD的单域抗体，对精准阻断SARS-CoV-2的感染具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体，具有针对新型冠状病毒SARS-Cov-2的高效抗病毒能力。同时，还提供该抗体的应用。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体，所述单域抗体由重链构成，其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：DFDFYDY；ii、所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IGEIHHSGSTYYNPSLKSRV；iii、所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：VKDFVGADGPFVFDY。优选地，所述重链包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3。优选地，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述重链具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。本专利技术还提供：编码前文所述抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体的核酸。优选地，所述核酸的序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供：前文所述抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体用于制备诊断试剂或诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。前文所述核酸用于制备抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体、诊断试剂或诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。其中，所述药物或药物组合物具有针对新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性抗病毒作用。一种药物组合物，包括药物活性成分，其特征是，所述药物活性成分包括前文所述抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体，以及氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的SARS-CoV-2中和性抗体4A3。该药物组合物具有针对新型冠状病毒SARS-Cov-2的D614G突变株的协同中和效应。本专利技术通过噬菌体展示技术获得了SARS-CoV-2特异性全人源单克隆单域抗体，具有SARS-Cov-2伪病毒中和作用，且与IgG型SARS-CoV-2中和性抗体4A3联合使用对D614G突变株伪病毒具有协同中和效应。本专利技术为COVID-19的预防和治疗提供了有效的备选抗体药物，具有潜在的临床应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1中ELISA检测富集噬菌体对抗原的结合情况图。图2为本专利技术实施例2中4D8克隆对SARS-CoV-2-RBD蛋白的特异性结合检测(PhageELISA)图。图3为本专利技术实施例3中pFUSE-4D8-hFC质粒图谱。图4为本专利技术实施例3中单域抗体4D8纯度鉴定图。图5为本专利技术实施例4中ELISA检测单域抗体4D8对SARS-CoV-2-RBD蛋白的结合特异性图。图6为本专利技术实施例5中单域抗体4D8的伪病毒中和效应评估图。图7为本专利技术实施例6中4D8与4A3联合使用对D614G突变株伪病毒的协同中和效应图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。但是本专利技术不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。实施例1本实施例为筛选靶向SARS-CoV-2-RBD的全人源单域抗体。以TomlinsonI&J噬菌体文库(GenserviceLtd.，Cambridge，UK，文库大小为1.47×108)抗体序列为模板，克隆出该文库抗体重链序列，构建单域抗体文库。采用噬菌体展示技术，以SARS-CoV-2-RBD-his(Arg330-Val524)蛋白为抗原在单域抗体文库中进行筛选。具体过程如下：使用50μg/mlSARS-CoV-2-RBDhis抗原于4℃包被酶标板过夜，50ul/孔；用含有5％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液(PBSTM)室温封闭酶标板1小时；单域抗体噬菌体文库以1012pfu与10％脱脂奶粉PBS溶液(PBSM)1:1混合后室温孵育，2小时后转移至封闭好的SARS-CoV-2-RBDhis抗原酶标板中(100μl/孔)，室温孵育1小时。用0.1％Tween-20的PBS溶液(PBST)洗涤酶标板20次；100μl100mMTriethylamine本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体，所述单域抗体由重链构成，其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：/ni、所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：DFDFYDY；/nii、所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IGEIHHSGSTYYNPSLKSRV；/niii、所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：VKDFVGADGPFVFDY。/n
【技术特征摘要】
1.一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体，所述单域抗体由重链构成，其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：DFDFYDY；
ii、所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IGEIHHSGSTYYNPSLKSRV；
iii、所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：VKDFVGADGPFVFDY。
2.根据权利要求1所述的中和性单域抗体，其特征是，所述重链包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3。
3.根据权利要求2所述的中和性单域抗体，其特征是，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.根据权利要求1或2或3所述的中和性单域抗体，其特征是，所述重链具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
5.编码权利要求1至4任一项所述抗新型冠状病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：高威，马素娟，叶伟，敖磊，刘晓宇，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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