用于缀合可活化抗体的组合物和方法技术

本发明专利技术主要涉及用于缀合抗体和可活化抗体的组合物和方法，和在与试剂(例如治疗剂和/或诊断剂)缀合(例如基于巯基的缀合)之前部分地还原抗体和/或可活化抗体的方法。

Compositions and methods for conjugation of activated antibodies

The present invention relates to a conjugated antibody and antibody can be used for activation of the compositions and methods, and the kit (such as therapeutic agents and / or diagnostic agent (for example) conjugated thiol conjugates based on partial reduction method) before antibody and / or activation of antibody.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2013年6月4日提交的美国临时申请号61/830,913和2013年12月23日提交的美国临时申请号61/919,935的权益。其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。专利
本专利技术主要涉及用于缀合抗体和可活化抗体的组合物和方法，和在与试剂(例如治疗剂和/或诊断剂)缀合(例如基于巯基的缀合)之前部分地还原抗体和/或可活化抗体的方法。专利技术背景基于抗体的疗法已证明有效治疗一些疾病，但在一些情况下，由于广泛的靶标表达导致的毒性限制了其治疗功效。此外，基于抗体的疗法已显示其它局限性，例如在给予后从循环中快速清除。抗体的缀合剂已用于进一步增进基于抗体的疗法的应用。分子例如毒素、放射性核素和药物，包括抗-癌症药物，已与某些抗体缀合，以产生免疫毒素、放射免疫缀合物和/或抗体-药物缀合物(ADC)。在小分子治疗领域，已发展提供活性化学实体的前药的策略。这样的前药以相对无活性(或显著较少活性)的形式给予。一旦给予，前药在体内代谢成活性化合物。对于其预期靶标和对于减少副作用，这样的前药策略可提供增加的药物选择性。因此，在基于抗体的疗法的领域中，对模拟小分子前药需要特性的抗体存在持续的需要，以及对将试剂与这些抗体缀合而未负面影响其模拟小分子前药需要的特性的能力的改进方法存在需要。专利技术简述本专利技术提供包含可活化抗体的缀合物和制备这些可活化抗体缀合物的方法。还提供具有接受药物或标签的缀合点的可活化抗体。所述缀合物可在治疗上使用，在诊断上使用(例如，体外或体内)，用于体内成像，和用于各种其它治疗、诊断和/或预防应用的任一种。通常，本文提供的组合物和方法包括可活化抗体，其包括特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中AB与降低AB结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM)偶联。在一些实施方案中，可活化抗体进一步包括作为蛋白酶的底物的可裂解部分(CM)。本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂与AB中的一个或多个半胱氨酸残基连接，而不损害可活化抗体的活性(例如，掩蔽、激活或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂与AB中的一个或多个半胱氨酸残基连接，而不还原或以其它方式破坏在MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生与一种或多种试剂(例如各种治疗、诊断和/或预防剂的任一种)缀合的可活化抗体，和在一些实施方案中，没有任何试剂与可活化抗体的MM缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗体，其中MM保留有效地和高效地掩蔽在未裂解状态中的可活化抗体的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗体，其中可活化抗体在可裂解CM的蛋白酶存在的情况下仍被活化，即裂解。可活化抗体具有至少一个试剂的缀合点，但在本文提供的方法和组合物中并非所有可能的缀合点可用于试剂的缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间硫键的硫原子，而不是参与链内二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或含有硫原子的其它氨基酸残基的硫原子。这样的残基可天然存在于抗体结构中或可通过定点诱变、化学变换或错误掺入非天然氨基酸而掺入至抗体。还提供制备在AB中具有一个或多个链间二硫键和在MM中具有一个或多个链内二硫键的可活化抗体的缀合物的方法，和提供了对游离巯基有反应性的药物。所述方法通常包括用还原剂，例如TCEP，部分地还原可活化抗体中的链间二硫键；和将对游离巯基有反应性的药物与所述部分还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指其中可活化抗体与还原剂接触和并非所有二硫键，例如并非所有可能的缀合位点被还原的情况。在一些实施方案中，少于99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少于5%的所有可能的缀合位点被还原。在一些实施方案中，提供还原可活化抗体和将试剂例如药物与所述可活化抗体缀合的方法，所述可活化抗体产生定位所述试剂的选择性。所述方法通常包括用还原剂部分地还原可活化抗体，使得在可活化抗体的掩蔽部分或其它非-AB部分中的任何缀合位点不被还原，和将所述试剂与AB中的链间巯基缀合。选择缀合位点，以允许试剂的所需定位，以允许缀合在所需位点上发生。还原剂为例如TCEP。还原反应条件，例如还原剂与可活化抗体的比率、孵育期限、孵育期间的温度、还原反应溶液的pH等，通过鉴定产生缀合的可活化抗体的条件来确定，其中MM保留有效地和高效地掩蔽未裂解状态的可活化抗体的AB的能力。还原剂与可活化抗体的比率将取决于可活化抗体而改变。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率的范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，所述比率范围为约5:1至1:1。在一些实施方案中，所述比率范围为约5:1至1.5:1。在一些实施方案中，所述比率范围为约4:1至1:1。在一些实施方案中，所述比率范围为约4:1至1.5:1。在一些实施方案中，所述比率范围为约8:1至约1:1。在一些实施方案中，所述比率范围为约2.5:1至1:1。在一些实施方案中，提供还原可活化抗体的AB中的链间二硫键和将试剂例如含巯基试剂例如药物与得到的链间巯基缀合以选择性定位试剂到AB上的方法。所述方法通常包括用还原剂部分地还原AB以形成至少2个链间巯基，而在可活化抗体中不形成所有可能的链间巯基；和将试剂与部分还原的AB的链间巯基缀合。例如，将可活化抗体的AB在约37℃以所需比率的还原剂:可活化抗体部分地还原约1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种部分地还原可活化抗体和将试剂与所述可活化抗体缀合的方法，所述可活化抗体产生所述试剂定位的选择性，所述方法包括用还原剂部分地还原所述可活化抗体中的至少1个二硫键，而不破坏所述可活化抗体中的任何链内二硫键，和将所述试剂与至少1个巯基缀合，其中所述可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制呈未裂解状态的所述可活化抗体的AB与所述靶标结合的掩蔽部分(MM)、和与AB偶联的可裂解部分(CM)，其中CM是起蛋白酶的底物作用的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.04 US 61/830913;2013.12.23 US 61/9199351.一种部分地还原可活化抗体和将试剂与所述可活化抗体缀合的方法，所述可活化抗
体产生所述试剂定位的选择性，所述方法包括用还原剂部分地还原所述可活化抗体中的至
少1个二硫键，而不破坏所述可活化抗体中的任何链内二硫键，和将所述试剂与至少1个巯
基缀合，其中所述可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制呈
未裂解状态的所述可活化抗体的AB与所述靶标结合的掩蔽部分(MM)、和与AB偶联的可裂解
部分(CM)，其中CM是起蛋白酶的底物作用的多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述至少1个二硫键是链间二硫键。
3.权利要求1的方法，其中所述至少1个二硫键是所述可活化抗体和第二分子之间的二
硫键。
4.权利要求3的方法，其中所述第二分子是半胱氨酸或谷胱甘肽。
5.权利要求1的方法，其中未裂解状态的所述可活化抗体具有如下从N-端至C-端的结
构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
6.权利要求1的方法，其中所述还原剂是TCEP。
7.权利要求1的方法，其中所述试剂选自表4中所列的试剂。
8.权利要求1的方法，其中所述试剂是毒素或其片段。
9.权利要求8的方法，其中所述试剂是微管抑制剂。
10.权利要求8的方法，其中所述试剂是核酸破坏剂。
11.权利要求8的方法，其中所述试剂是多拉司他汀、阿里他汀或其衍生物、类美登素或
其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、或卡奇霉素或其衍生物。
12.权利要求4的方法，其中所述试剂阿里他汀E或其衍生物。
13.权利要求4的方法，其中所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)或单甲基阿里他汀D
(MMAD)。
14.权利要求4的方法，其中所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
15.权利要求4的方法，其中所述试剂是单甲基阿里他汀D(MMAD)。
16.权利要求4的方法，其中所述试剂是DM1或DM4。
17.权利要求4的方法，其中所述试剂经过接头与AB缀合。
18.权利要求17的方法，其中所述接头是可裂解接头。
19.权利要求1的方法，其中所述试剂是可检测部分。
20.权利要求19的方法，其中所述可检测部分是诊断剂。
21.权利要求1的方法，其中所述靶标选自表1所列的靶标。
22.权利要求1的方法，其中AB是或源自选自表2所列的抗体的抗体。
23.权利要求1的方法，其中所述其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')2片段、scFv、
scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
24.权利要求1的方法，其中MM的结合AB的平衡解离常数大于AB对所述靶标的平衡解离
常数。
25.权利要求1的方法，其中当所述可活化抗体呈裂解状态时，MM不干扰AB结合所述靶
标，或不与AB竞争结合所述靶标。
26.权利要求1的方法，其中MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。
27.权利要求1的方法，其中MM多肽序列不同于所述靶标的序列，和其中MM多肽序列与
AB的任何天然结合配偶体具有不超过50%的同一性。
28.权利要求1的方法，其中MM与所述靶标不包括超过25%的氨基酸序列同一性。
29.权利要求1的方法，其中MM与所述靶标不包括超过10%的氨基酸序列同一性。
30.权利要求1的方法，其中CM是长度至多15个氨基酸的多肽。
31.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶与所述靶标在组织中共定位，和其中当所述可
活化抗体暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶裂解所述可活化抗体中的CM。
32.权利要求1的方法，其中所述可活化抗体包含在MM和CM之间的连接肽。
33.权利要求1的方法，其中所述可活化抗体包含在CM和AB之间的连接肽。
34.权利要求1的方法，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽
...

【专利技术属性】
技术研发人员：AW康拉迪，S辛格，HB洛曼，LR德斯诺耶斯，TW梁，
申请(专利权)人：西托姆克斯治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US