双互补位A-β结合多肽制造技术

本发明专利技术涉及双互补位A-β结合多肽，更具体地涉及包含至少两个结合于A-β的不同抗原表位的免疫球蛋白单一可变域的双互补位A-β结合多肽。本发明专利技术还涉及所述多肽的具体序列、其制备方法及其使用方法，包括治疗例如阿尔茨海默氏病的疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的P -淀粉样肽(以下为“A-e ”)结合多肽，所述多肽包含特定免疫球蛋白域。本专利技术还涉及编码所述多肽的核酸；制备所述多肽的方法；表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；包含所述多肽的组合物；及所述多肽或所述组合物尤其用于预防性、治疗性及诊断性目的用途。
技术介绍
若干种退行性神经疾病由蛋白质的不当折叠或加工引起或由朊病毒引起，两者皆会导致侵入性神经沉积，称为淀粉样斑。最广为人知的退行性神经疾病为阿尔茨海默氏病(AD)。AD的发病率证明迫切且未满足的医学需求所有65至85岁的人中10%至40%会 出现AD。此外，此部分的人数持续指数增长。因此，从人道以及社会与经济角度出发，急需找到有效诊断及治疗此破坏性病症的方法。关于治疗，药物不仅需要减缓或停止疾病进展，而且亦需要使在AD初期(在诊断之前)已出现的脑损伤恢复。此时，早期诊断与疗法治疗皆无效。AD定义为与大脑中存在主要由淀粉样肽构成的细胞外淀粉样斑及主要由蛋白T构成的细胞内神经原纤维缠结(NFT)同时发生的痴呆。作为AD特征的淀粉样斑的主要组分为P -淀粉样肽(A-0 )，其为长39-43个氨基酸(aa)且高度倾向于采用P折叠结构、寡聚并形成蛋白聚集体的高度不溶性肽。A-3由A-P前体蛋白(APP)通过两个溶解蛋白事件产生。A-^分泌酶活性使APP在A-P的氨基酸Met-671与Asp-672 (使用APP的770aa同工型的编号)之间的N端(“ P位点”)裂解。P位点的裂解产生99aa的膜相关APP片段(C99)。C99的跨膜域中的第二位点(“ Y位点”)可接着由Y-分泌酶裂解，释放A-P。或者APP可在其A-P区中，主要在APP的a -分泌酶裂解位点裂解，产生83aa的C端APP片段(C 83)，其亦可进一步由Y -分泌酶裂解，产生小的可溶性分泌肽P3。此路径减少A-P的潜在积累。细胞内及细胞外A-P采用P折叠构象且形成称为ADDL(淀粉样蛋白衍生的可扩散配体)的中间物及原纤维，最后以淀粉样原纤维的形式沉淀，所述淀粉样原纤维组装成淀粉样斑。在这些过程中，推测疏水性较大的A-P (1-42)肽(参考下文)充当所述斑块不断生长所环绕的成核剂。APP的许多错义突变与早发型家族性AD的形式有关。所有这些突变均在APP的一个经典裂解位点处或附近。因此，瑞典双突变(Swedish double mutation) (K670N/M671L)紧邻￠-分泌酶裂解位点且提高￠-分泌酶活性的效率，从而产生更多的总A-P。在Y-分泌酶裂解位点附近的APP残基717处的三个突变中的任一者可使A-P的更促淀粉样的42aa形式(亦称为A-3 (1-42))相对于更常见40aa形式A-P (1-40)的比例增加。已描述APP的另外两个突变，其靠近但不邻接a位点。佛兰德斯(Flemish)家族突变(A692G，A-^残基21)和荷兰(Dutch)家族突变(E693Q，A-^残基22)各与家族性AD的不同形式有关。具体而言，佛兰德斯突变呈现为重复脑内出血的综合征或AD型痴呆。神经病理学发现包括皮质及海马区中的老年斑，及通常大脑微血管壁中的多个淀粉样沉积物。若干年前，已显示膜相关天冬氨酰基蛋白酶BACE(亦称为曼普辛(memapsin)或Asp2)呈现对￠-分泌酶所期望的性质。此酶以类似效率使APP在其P位点处及A-@区的Tyr-IO与Glu-Il之间裂解。已在AD的淀粉样斑中及经APP转染的HEK293人胚肾细胞的培养基中观察到在后者的位点处裂解的A-P折叠段。若干小组亦观察到数据库中存在另一天冬氨酰基蛋白酶BACE2(亦称为Aspl)，其为BACE(现亦称为BACE1)的相近同源物。BACE2使APP在其P位点处裂解，及更有效地在APP的A- P区中A- P的Phe_19及Phe_20后的位点处裂解。这些内部A-P位点相邻于残基21的佛兰德斯APP突变，且此突变显著增加由BACE2产生的P位点裂解产物的比例。增加(瑞典突变)或抑制(M671V) P -分泌酶活性的APP保守性P位点突变类似地影响BACEl及BACE2活性。类似于BACE1，BACE2在酸性pH值下最大限度地分解APP。APP基因或早老素Upresenilin I,PSl)基因(带有“ Y -分泌酶”活性)的突变引起早发型家族性AD。APP突变的实施例为分别位于P及Y分泌酶裂解位点附近的上述 “瑞典”及“伦敦(London)” (717)突变。这些突变增加A-P肽及尤其是A-P (1-42)的形成，由此增加淀粉样聚集体及斑块的形成。然而，最初的斑块被认为是发展AD的主要触发物，但当前研究却强调原纤维及ADDL作为主要毒性组分的作用。甚至可想象斑块为实际上使神经毒性肽无生物活性的机理。关于神经退化性疾病及A-P在其中的作用的其他信息可得自Wisniewski和 Konietzko (2008), Lancet Neurol 7 (9),805-811, Spires-Jones 等人(2009)，Neurobiology of Disease,213-220,以及 Lichlen 和 Mohajeri(2008), Journal ofNeurochem. 104. 859-874。当前大部分AD治疗旨在使用例如多奈哌齐(donepezil) (Aricept )、加兰他敏(galantamine) (Reminyl )及利伐斯的明(rivastigmine) (Exelon )的注册用于治疗轻度至中度AD的乙酰胆碱酯酶抑制剂使乙酰胆碱缺乏。在美国和加拿大，多奈哌齐亦获批准用于重度阿尔茨海默型痴呆(Dementia Alzheimer’stype, DAT)。乙酰胆碱缺乏反映基底前脑的胆碱能神经元退化且似乎与该疾病的神经精神病学表现非常有关。用乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗具有一定有益作用(对认知及全面功能的临床测量具有稳定且显著但适中的功效)，但无法治愈或停止疾病进展，因为未治疗到神经退化的病因。美金刚(Memantine)(Axum'.K:、Namenda . libiXa-il'；Merz Pharmaceuticals)为一种NMDA受体拮抗剂，其在患中度至重度阿尔茨海默氏病的AD患者中在临床领域认知、日常生活活力及整体临床反应方面的结果均优于安慰剂。美金刚仍然仅为批准用于中度至重度阿尔茨海默氏病的对症治疗。其既不治愈亦不停止疾病进展。已显示美金刚与乙酰胆碱酯酶抑制剂的组合在中重度至重度DAT而非轻度至中度疾病阶段中具有优良功效。一些当前实验性治疗策略集中于A-P上，将其作为靶标。存在三个主要研究路线 a)开发称为P折叠裂解剂的小分子(常常为肽模拟物)，其经设计以干扰淀粉样肽聚集体的P折叠结构。已证明稳定“ P折叠裂解剂”在给予AD的转基因小鼠模型时能够穿透血脑屏障且减少斑块数目(Permanne等人(2002)，FASEB J. 16，860-862)。有待证明此方法是否会引起认知保护和/或恢复。b)开发抑制APP经溶解蛋白加工成淀粉样肽的小分子。0或Y分泌酶的抑制剂应有效地阻断A-P的形成且因此保护大脑免受淀粉样蛋白的神经毒性作用。未预期对已存在的脑A-P负荷(例如已积累多年的淀粉样斑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.03 EP 10155339.41.一种多肽，其包含特异性结合于A-P的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和特异性结合于A-P的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述A-e的第一抗原表位和第二抗原表位为不同的抗原表位。2.权利要求I的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域各自基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至CDR3)组成，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域由接头肽共价连接，其中所述接头肽任选包含第三免疫球蛋白域或由其组成。3.权利要求I或2的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域为抗体域，优选为VHH域，更优选为人源化VHH域。4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述A-P的第一抗原表位为SEQID N0:3定义的抗原表位且所述A-P的第二抗原表位为SEQ ID N0:4定义的抗原表位，或其中所述A-^的第一抗原表位为SEQ ID NO: 4定义的抗原表位且所述A-P的第二抗原表位为SEQID NO:3定义的抗原表位。5.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽至少与人类A-P肽(SEQID NO: I)的氨基酸I (天冬氨酸)、3 (谷氨酸)、19 (苯丙氨酸)、20 (苯丙氨酸)和23 (天冬氨酸)形成接触。6.前述权利要求中任一项的多肽，其中在TR-FRET结合测试(使用ABII002=SEQIDNO:62和ABII050=SEQ ID NO: 100作为竞争者)中所测量，IC50值在I(T9摩尔/升或小于1(T9摩尔/升范围内，优选在5X10_1CI摩尔/升至10_12摩尔/升的范围内。7.权利要求2至6中任一项的多肽，其中所述多肽包含两个A-P结合免疫球蛋白单一可变域，所述免疫球蛋白单一可变域分别具有结构FR (I) I-CDR (I) I-FR (I) 2-CDR (I) 2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4 和 FR(2) I-CDR(2) 1_FR(2) 2_CDR(2) 2-FR (2) 3_CDR(2) 3_FR(2) 4，且其中 CDR(1)3 选自 -SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；及 -分别与SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列 '及 CDR(2)3 选自 -SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及 -与SEQ ID NO: 19的所述氨基酸序列相比有至多三个，优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列 或其中 CDR(1)3 选自 -SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及 -与SEQ ID NO: 19的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；及 CDR⑵3选自 -SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；及 -分别与SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。8.权利要求2至7中任一项的多肽，其中所述第一免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR(I)序列)和所述第二免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR(2)序列)定义如下-CDR(I)I SEQ ID NO: 11-CDR(I) 2 SEQ ID NO:12-CDR(I) 3 SEQ ID NO:13-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2) 2 SEQ ID NO:18-CDR(2) 3 SEQ ID NO:19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 14-CDR(I) 2 SEQ ID NO:15-CDR(I) 3 SEQ ID NO:16-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2) 2 SEQ ID NO:18-CDR(2) 3 SEQ ID NO:19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I) 2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:11-CDR(2)2 SEQ ID NO:12-CDR(2) 3 SEQ ID NO:13或 -CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I)2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:14-CDR(2)2 SEQ ID NO:15-CDR(2)3 SEQ ID NO:16。9.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035 (SEQ IDNO: 44)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059 (SEQ ID NO: 45)，或其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059(SEQ ID NO:45)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为 VHH 域 ABII035 (SEQ ID NO: 44)。10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长部分。11.权利要求10的多肽，其中所述半衰期延长部分共价连接于所述多肽且选自例如抗白蛋白免疫球蛋白域的白蛋白结合部分、例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域的转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。12.权利要求10至11中任一项的多肽，其中所述多肽选自具有SEQID NO:26至32、.34 至 43、142、143 及 145 至 152 的多肽。13.一种多肽，其包含免疫球蛋白单一可变域或由其组成，所述免疫球蛋白单一可变域基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至⑶R3)组成，其中所述CDR序列定义如下-CDRl SEQ ID NO:11-CDR2 SEQ ID NO:12-CDR3 SEQ ID NO:13pf -CDRl SEQ ID NO:14-CDR2 SEQ ID NO:15-CDR3 SEQ ID NO:16或-CDRl SEQ ID NO:17-CDR2 SEQ ID NO:18...

【专利技术属性】
技术研发人员：JE帕克，C多纳西奥塞克，S霍伊尔，L库斯茂尔，M伦特，K齐默曼，G贝斯特，T赖雷曼斯，P莫其尔斯，J沃卡曼，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆国际有限公司，
类型：发明
国别省市：