一种重组抗OPN单克隆抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种重组抗OPN单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了编码该单克隆抗体的DNA分子，表达该单克隆抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明专利技术提供的抗OPN单克隆抗体能快速检测血清中OPN的浓度，灵敏度高，特异性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学
具体地说，本专利技术涉及一种新的抗OPN单克隆抗体，及其制备方法和用途。
技术介绍
Osteopontin(OPN)为早期的T淋巴细胞活化分子I (Etal),是具有多种功能的分泌型糖蛋白。其可能的功能包括参与骨骼代谢，免疫调节，创伤愈合，细胞生存及肿瘤的进展。根据基因结构及染色体位置，OPN是整合素结合配体家族成员，为一小分子的N连接糖蛋白(SIBLING)，该家族还包括骨骼唾液酸蛋白(BSP)，牙基质蛋白I (DMPl)，牙齿唾液酸磷酸蛋白(DSPP)以及磷酸化糖蛋白细胞外基质(MEPE)。人OPN cDNA编码314个氨基酸残基的前体蛋白，其中包含16个氨基酸的信号肽，剪切后形成298个氨基酸的成熟蛋白。OPN为一高度酸化的多功能域的蛋白，理论分子量约33kDa，但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75kDa。OPN主要由骨骼、肾脏和上皮组织表达，但也可在子宫内膜组织、内皮细胞、T细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞及许多的肿瘤组织中检测到。在某些病理过程中组织中OPN的表达会上调，包括动脉硬化、瓣膜狭窄、心肌梗塞及类风湿性关节炎。OPN在数种生物体液中都可检测到，包括人血浆、血清、乳汁及尿液，在某些恶性肿瘤、爆发性肝炎、结核及自身免疫性疾病如多发性硬化和红斑狼疮中其表达上调。OPN的活性可通过一系列受体介导，包括许多整合素和透明质酸受体⑶44。OPN含有多个与整合素结合的功能域。其典型的Arg-Gly-Asp (RGD)位点可与数种v类型的整合素(vl，v3, v5)及51，81结合，含有Iopinavir(LPV)的区域可以结合41，SVVYGLR位点可以结合41，47和91。OPN和可以结合⑶44的变异体，可能通过与整合素的共同作用促进细胞迁移。细胞内的OPN通过与⑶44及ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白的相互作用或是通过调节细胞表面的⑶44表达而促进细胞的迁移。OPN及其蛋白酶解产物具有相互调节的作用。OPN被凝血酶、MMP-3、MMP-7或MMP-12酶解后产生OPN片段，与完整的OPN具有不同的生物学功能。例如，凝血酶、MMP-3、 MMP-7酶切后可以增强整合素依赖的细胞粘附和迁移。反之，OPN通过包括转化/活化前体或是再活化TIMP抑制的酶的机制活化MMP-2和MMP-3。如其命名，OPN在骨骼的代谢中发挥一定的作用。在体外，OPN可刺激破骨细胞向骨骼粘附，如果抑制这种相互作用，则可以阻断骨骼的再吸收。OPN基因敲除的小鼠骨骼的发育表观上是正常的，但表现出出生后某些部位骨骼再吸收的缺陷，因此也支持OPN对破骨细胞的作用。OPN还直接参与调节矿物晶体的形成及生长。在体内和体外，OPN与羟基磷灰石结合可抑制晶体的形成。炎症反应的介导因子包括LPS，N0，IL-UP TNF均可刺激OPN的表达。OPN调节巨噬细胞的分化和聚集。OPN还具有趋化因子及T细胞共刺激分子的功能，其可促进Thl细胞因子IL-12的产生。OPN基因敲除的小鼠表现为Thl反应的缺陷以及易于发生细菌和病毒的感染。但OPN在某些条件下也可抑制炎症反应。如在体外，OPN可抑制骨关节炎软骨细胞数种炎性介质的释放。由于OPN具有重要的生理及病理学意义，因此，检测OPN的血清浓度具有潜在的生理及病理学意义，所以迫切需要一种能有效、快速检测OPN在血清中浓度的产品。
技术实现思路
本专利技术的需要解决的技术问题之一是提供一种重组的抗OPN单克隆抗体，以克服现有技术的不足。本专利技术需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗OPN单克隆抗体的DNA分子。本专利技术需要解决的第三个技术问题是提供一种上述单克隆抗体的用途。 本专利技术需要解决的第四个技术问题是提供一种该单克隆抗体的制备方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术一方面提供了一种重组的抗OPN抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。本专利技术另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQID NO :3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQID NO 4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。本专利技术第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。本专利技术第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。本专利技术第五反面提供了一种试剂盒，含有重组的抗OPN抗体。本专利技术第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体,该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。本专利技术的优点在于本专利技术的单克隆抗体能快速、灵敏的检测患者血清中OPN的浓度。附图说明图I :载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点。图2 :本专利技术所构建的PM载体。其中，hCMV pro为人巨细胞病毒早期启动子；Ck为小鼠轻链恒定区基因；IgGl constant为小鼠、I重链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨节青霉素抗性基因。图3 :本专利技术所构建的pM(H+L)载体，含有重组抗OPN抗体重链全长和轻链全长基因。图4 :抗OPN单克隆抗体与市售OPN单克隆抗体检测OPN灵敏度的比较实验结果。具体实施例方式本专利技术涉及一种重组的抗OPN单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列。本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用 任何特殊方法来生产抗体。本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组抗OPN单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李博华，钱卫珠，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：