用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽及其筛选方法、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，其特征在于，由四个HPV表位肽C‑端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述表位肽的氨基酸序列为，Tyr‑Met‑Leu‑Asp‑Leu‑Gln‑Pro‑Glu‑Thr‑Gly‑Gly‑Gly。本发明专利技术还提供了所述树状多肽的筛选制备方法，以及应用。本发明专利技术利用多种组合生物信息学软件设计和分析，提高了发现新抗原表位的能力，使负载表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性。本发明专利技术的表位肽结构与性质单一，具有特异性高、无潜在生物危害性、制备工艺可标准化等巨大优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及宫颈癌的防治
，涉及一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽及其筛选方法、制备方法和应用。
技术介绍
宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤,严重威胁着妇女的健康和生命。我国是宫颈癌高发国家,特别是近年来年轻宫颈癌患者有明显上升趋势,发病率以每年2％-3％速度增长。人乳头瘤病毒(human papiIomavirus，HPV)可引起良、恶性增生，特别是高危型HPV与宫颈癌的关系密切。目前，对宫颈癌的治疗多采用手术、化疗、放疗、生物治疗和中医疗法联合应用。这些疗法的共同缺陷是缺乏特异,对正常组织细胞损伤大,毒副作用大,不但疗效不能满意,而且医疗费用巨大。近年来，主动的、特异的细胞免疫治疗因其独特的优势将成为宫颈癌治疗的理想手段。随着免疫识别理论、分子生物学知识和电子显微技术的不断进展与突破,大量研究证实发现T细胞对于抗原的识别是与MHC分子结合递呈的抗原短肽。即当外源性抗原被抗原呈递细胞捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细胞表位与MHC I类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答，发挥免疫调节作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供用于对HPV感染进行细胞治疗的树状 多肽，可应用于致敏体外培养的树突状细胞，使其携带抗原信息，致敏后的树突状细胞可用于治疗高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述树状多肽具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly。进一步地，所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。进一步的，所述表位肽采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16 E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测得到。进一步的，所述的树状多肽，采用固相合成法制备进行制备。进一步的，通过多聚精氨酸骨架将上述表位肽连接成4分枝状多聚抗原肽。进一步的，选择棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行T细胞表位肽的修饰。进一步的，所述的树状多肽，应用于致敏树突状细胞，或应用于制备优势表位肽疫苗。进一步的，所述优势表位肽疫苗和优势表位肽致敏的树突状细胞应用于治疗高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用多种组合生物信息学软件设计和分析，极大地提高了发现新抗原表位的能力，使负载表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性。与病原微生物裂解物和重组蛋白比较，本专利技术的表位肽分子量小，结构与性质单一，具有特异性高、无潜在生物危害性、制备工艺可标准化等巨大优势。基于T-DC的细胞治疗可以重建宫颈局部的免疫应答，靶向性的深入病变局部，清除癌变细胞或被感染细胞内的HPV，对正常细胞无任何杀伤作用。重建宫颈局部免疫能力，从而达到彻底杀灭、清除病毒的目的，修复受损上皮细胞和局部组织，进一步使难以治愈、反复发作的宫颈疾病消失，从而有效的阻断了宫颈粘膜从癌前病变的各阶段向宫颈癌阶段的发展。启动感染局部组织对HPV的特异性清除，修复受损的上皮细胞和局部组织。同时，可以在体内形成长期免疫记忆，加强免疫防治效果，为防止复发或再感染提供长期保护通过多聚精氨酸骨架将上述表位肽连接成4分枝状多聚抗原肽，增加了分子量和生物活性，使连接的表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性。甘氨酸的增加可提高肽的免疫调节作用，增加免疫活性。在T细胞表位的N-末端加上棕榈酰基可以增加小分子肽在细胞膜上的定位、跨膜及穿透能力。为了提高T细胞表位通过外源性途径引发CTL反应的能力，我们选择了棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行T细胞表位肽的修饰。相对无修饰的对照组，经修饰后的表位肽可使细胞活性呈现极显著升高(p<0.01)。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。一、表位肽的设计与筛选1.人乳头瘤病毒抗原及其同源性分析HPV16、18型是最常见的高危型，是宫颈癌及其癌前病变的主要致病因子。特别是HPV16型在宫颈癌组织中的检出率超过50％，在宫颈癌的发生中起着重要作用。研究表明，HPV16 E7蛋白是肿瘤细胞转化的主要癌蛋白，通过结合并失活肿瘤抑制蛋白Rb而发挥转化作用。从Genebank中选择HPV16 E7蛋白，其98个氨基酸序列：MHGDT PTLHE YMLDT QPETT DLYCY EQLND SSEEE DEIDG PAGQA EPDRA HYNIV TFCCK CDSTL RPLCVQ STHVD IRTLE DLLMG TLGIV CPICS QKP，将E7蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast,以确定该段蛋白质的特异性。2、HPV16 E7抗原的一般特性预测应用软件CLC Protein Workbench3版本和Signal P3.0软件对蛋白质进行预测，包括疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点。本专利技术采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16 E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测。3、利用SYFPEITHI数据库进行CTL表位初步预测4、通过PREDEPP数据库进行MHCI类结合基序预测。5、基序法(1)不同的MHCI类对所结合的肽的组成有不同的要求，但其中起主要作用进而对肽链与MHCI类分子的结合有重要影响的是肽链的两个主要锚点残基，他们在多肽与MHCI类分子的高亲和力结合中是必需的。(2)二级锚点残基的作用除了两个主要锚点残基的必需因素外，多肽链中的其他氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的高或中等亲和力结合也有不可忽视的影响。在其他位置上，不同氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的结合有着不同的影响，有的氨基酸残基有利于结合，而有的则不利于结合。理想的与HLA-A2结合的CTL表位(即有高的或中等亲和力)应不包含不利于结 合的氨基酸残基，或有利于结合的残基多于不利于结合的残基。6、多项式方案预测表位肽多项式方案是指当某残基R出现在某肽的第I位时，不考虑其他肽序列的情况下，该残基对于整个肽与MHCI类分子的结合自由能提供了一常量Ri，用在第I位为残基R的大量多肽的IC50的负log10值的平均值来估计此常量。IC50被定义为待测肽将对照肽-MHC复合物中50％的对照肽置换下来的浓度。将其所有氨基酸残基对应的Ri值相加，选择分值大于选定阈值的抗原肽为可能的后选肽。将SYFPEITHI数据库的预测结果和PREDEPP数据库的预测结果进行对比，筛选出作为T细胞表位肽的可能性最大的5条肽:TLHEYMLDL(E7 7-15)、YMLDLQPET(E7 11-19)、RAHYNIVTF(E7 49-57)、RLCVQSTHV(E7 66-74)、LIMGTLGIV(E7 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，其特征在于，由四个HPV表位肽C‑端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述树状多肽具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr‑Met‑Leu‑Asp‑Leu‑Gln‑Pro‑Glu‑Thr‑Gly‑Gly‑Gly。

【技术特征摘要】
1.用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，其特征在于，由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述树状多肽具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly。2.根据权利要求1所述的用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，其特征在于，所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。3.筛选权利要求1或2所述的树状多肽的方法，其特征在于：所述表位肽采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16E7编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗进，闫小君，
申请(专利权)人：江苏安泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32