本发明专利技术涉及鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的生产方法。本发明专利技术从鸭肝炎病毒优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，此卵黄具有高效、安全性好、保护率高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术 涉及一种用于预防由I型和新型，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(duckviral hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitisvirus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀和出血为特征性病变。I 3周龄的雏鸭易感，发病严重，传播迅速，雏鸭通常出现症状后的I小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率90 95%，已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。鸭肝炎病毒(DHV)血清型DHV有4个独立的血清型，I型、2型、3型和新型。范书才等(范书才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报，2009，10)通过试验证明目前在我国同时存在I型和新型DHV流行。血清中和试验表明，I型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个型的DHV中，I型与新型DHV流行最广泛，毒力最强；对3周龄内的雏鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行，致死率低(约20%)。目前国内、外尚无商品化的二价卵黄抗体，由于I型和新型之间无交叉保护作用，I型卵黄抗体很难对流行的新型鸭肝炎病毒进行预防，因此研制I型和新型二价卵黄抗体是预防和控制鸭病毒性肝炎的必然要求，针对此要求我们研制了鸭病毒性肝炎I型和新型二价精制卵黄抗体。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins),简称为IgY。卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血衆蛋白，IgG被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。卵黄抗体的形成过程是当机体受到外界特异性抗原(尤其是灭活抗原)的刺激后诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体IgG(所有亚群)由卵巢IgG受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来，也正是由于这种卵黄累积作用，使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量，而血清中的其他抗体(主要是IgM, IgA)与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75°C条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90°C处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH < 4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在PH4-12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH > 12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4°C保存可达5年以上，活性仅下降5%左右。由于具有这些稳定的理化性质，所以其的开发应用备受人们所关注。对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也在控制该病的流行中发挥着重要作用。由于卵黄抗体成本比较低且比较容易获得，所以已广泛使用于一些疾病的预防和治疗。但由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，所以人们采取各种办法从卵黄中提取分离IgY。常用的方法有聚乙二醇、硫酸葡聚糖、有机溶剂、水稀释法、辛酸法等。在此基础上，我们进行了鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗的研制工作。研制结果表明，我们研制的卵黄抗体效价高，安全性好，保护率高，为预防鸭病毒性肝炎病奠定了坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备I型和新型鸭肝炎病毒性的两种抗原，并进行合理配制成鸭病毒性肝炎I型和新型二价油乳剂灭活疫苗，用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，可同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此 卵黄具有抗体效价高、保护率高、安全性好等优点。本专利技术所涉及的卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的抗体，可同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎。该卵黄抗体的主要相关内容和所采用的技术手段(I)选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出效价高、免疫原性好制苗用毒株——鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株。(2)在卵抗的生产过程中用超滤浓缩柱将卵抗经过超滤浓缩，使卵抗的效价高，保护率高。(3)制备鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体主要步骤为①用鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。②将制备的二价灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋。③将收集的高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活。本专利技术详细描述一、生产用毒株制苗免疫原用鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus) I型YBHl株和新型YBHX株，均由青岛易邦生物公程有限公司分离、鉴定、保管和供应。国内分离株I型YBHl株和新型YBHX株(两型毒株均是2008年从山东省某鸭场病死鸭的肝脏中分离)，已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。二、疫苗(免疫原)的制备I.制苗用病毒液的制备(I)YBHl株病毒液制备将生产用毒种YBHl株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸡胚，置2 8°C放置4 12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。(2)YBHX株病毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12 13日龄易感鸭胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸭胚，置2 8°C 4 12小时，收取尿囊液、羊水及胚体(去掉头和四肢)。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min,取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。2.浓缩将收获的YBH l株和YBHX株病毒液在2 8°C条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本专利技术以下简称“现行《中国兽药典》”)规定进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。每O. 2ml病毒含量均应不低于IO6 3ELD5tlt5浓缩后的胚液随即进行灭活。3.灭活分别将浓缩后的YBHl株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为O. 2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时(以罐内温度达到37°C开始计时)后取出，置2 8°C保存，应不超过3个月。4.鸭病毒性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体，其特征在于该卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株的抗体，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐保娟，宫晓，郭伟伟，王龙，孙健，胡潇，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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