本发明专利技术提供一种检测沙丁胺醇的酶联免疫试剂盒及方法，酶联免疫试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、沙丁胺醇特异性抗体、酶标记物、沙丁胺醇标准溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液。本发明专利技术提供了一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒检测方法，主要包括：先进行样本前处理，再用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术的检测试剂盒可应用于动物组织(肌肉、肝脏)、尿液、饲料样本中沙丁胺醇的残留量的检测，其操作简便、快速、准确、灵敏度高、费用低廉等，适合大量样本的筛查和现场监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测动物组织(肌肉、肝脏)、尿液、 饲料中沙丁胺醇的酶联免疫试剂盒及检测方法。
技术介绍
沙丁胺醇是一种强效选择性β -受体兴奋剂药物，临床上常用于治疗支气管哮喘、哮喘性支气管炎和肺气肿患者的支气管痉挛等呼吸系统疾病。因此药可以提高瘦肉率， 减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康极有危害，我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β -兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食品动物。目前，对于的残留检测主要有高效液相色谱法、液相色谱 质谱联用分析法、气相色谱法、毛细管区带电泳法、酶联免疫测定法等检测方法，仪器检测方法具有检测精确度高的优点，但其仪器化程度高，样品处理较复杂、检测费用高等，不适合用作大批样品的检测， 免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其应用。 一种沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒，其包括包被有包被原的酶标板、沙丁胺醇特异性抗体、酶标记物、沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液， 所述包被原为沙丁胺醇药物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。本专利技术所提供的沙丁胺醇酶联免疫试剂盒，所述沙丁胺醇药物抗原为沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。所述沙丁胺醇特异性抗体为沙丁胺醇单克隆抗体，是用沙丁胺醇免疫原免疫动物得到的。所述沙丁胺醇单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述沙丁胺醇单克隆抗体优选为沙丁胺醇鼠单克隆抗体。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。为了更方便的进行大量样本筛查和现场监控，所述试剂盒还包括沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液。所述标准品溶液为系列沙丁胺醇标准品溶液，ImL/瓶，浓度分别为O μ g/L、 O.1 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 9 μ g/L、2. 7 μ g/L、8.1 μ g/L。所述底物液A液为过氧化脲溶液,底物液B液为四甲基联苯胺溶液，所述的终止液为I 2mol/L的硫酸溶液，所述浓缩洗涤液为含I %吐温-20的O. 15 O. 2mol/LpH7. 4磷酸盐缓冲液，所述的样本稀释液为pH为7. 4 的O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液中吐温-20的含量为O. 5%混合溶液配制而成的稀释液进行稀释。其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9. 6的O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为10%的小牛血清溶液。本专利技术酶标板的制备主要为用包被缓冲液将包被原稀释成O. 2 O. 3 μ g/ml，每孔加入150μ 1，37°C环境中避光孵育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，洗涤液洗涤I 2次， 拍干，每孔中加入150 μ I封闭液，37°C避光孵育2h，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。本专利技术中包被原和免疫原的合成过程为1.半抗原合成(合成路线如图1)(I)取l_3g沙丁胺醇，溶入20-50ml DMF中，然后加入10%摩尔当量的TEMPO和 10%摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml O. 5M的NaHC03水溶液，室温下搅拌30分钟后，加 Al. 1-1. 5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物。(2) l-2g步骤(I)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20-30ml DMF中，加入2-5摩尔当量的乙二胺，室温至100°C反应5-20小时，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物。2.免疫原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原18mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8yl加入(I)中，室温下搅拌反应18h。 (3)取BSAlOOmg用5. 5ml水稀释后加入上述溶液中。(4)反应 24h 后加入 24mgNaBH4 反应 2h。(5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。3.包被原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原15mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8y I加入(I)中，室温下搅拌反应18h。(3)取0VA30mg用4. 5ml水稀释后加入上述溶液中。(4)反应 24h 后加入 24mgNaBH4 反应 2h。(5)用三蒸水透析48小时，即得包被原。4.单克隆抗体的制备动物免疫沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。细胞融合与克隆化取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。本专利技术还提供了一种用沙丁胺醇酶联免疫试剂盒检测样本中沙丁胺醇残留的方法，采用本方法对动物组织、饲料、尿液样本中的沙丁胺醇进行定性或定量检测，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样本，试剂盒具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点，主要步骤包括1)将待测样本进行前处理，得到待测样本溶液；2)用酶联免疫试剂盒检测待测样本溶液；3)分析检测结果。附图说明图1 :沙丁胺醇半抗原合成图图2:沙丁胺醇标准曲线具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例一抗原、抗体及酶标记物的制备1.沙丁胺醇半抗原的制备(1)取l-3g沙丁胺醇，溶入20-50ml DMF中，然后加入10%摩尔当量的TEMPO和 10%摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml O. 5M的NaHC03水溶液，室温下搅拌30分钟后，加 Al. 1-1. 5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物。(2) l-2g步骤(I)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20_30ml DMF中，加入2-5摩尔当量的乙二胺，室温至100°C反应5-20小时，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物。2.免疫原的制备(1)取沙丁胺醇半抗原18mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8y I加入(I)中，室温下搅拌反应18h。(3)取BSAlOOmg用5. 5ml水稀释后加入上述溶液中。(4)反应 24h 后加入 24mgNaBH4 反应 2h。(5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。3.包被原的制备(1)取沙丁胺醇半抗原15mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8y I加入(I)中，室温下搅拌反应18h。(3)取0VA30mg用4. 5ml水稀释后加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒，其包括包被有包被原的酶标板、沙丁胺醇特异性抗体、酶标记物、沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液，所述包被原为沙丁胺醇药物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。
【技术特征摘要】
1.一种沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒，其包括包被有包被原的酶标板、沙丁胺醇特异性抗体、酶标记物、沙丁胺醇标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液，所述包被原为沙丁胺醇药物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述沙丁胺醇药物抗原为沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。3.如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于所述的沙丁胺醇半抗原的制备方法主要包括如下步骤 (1)取l_3g沙丁胺醇，溶入20-50mlDMF中，然后加入10%摩尔当量的TEMPO和10%摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml O. 5M的NaHCO3水溶液，室温下搅拌30分钟后，加入1.1-1. 5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物。(2)l-2g步骤(I)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20-30ml DMF中，加入2-5摩尔当量的乙二胺，室温至100°C反应5-20小时，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物。4.如权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，冯才伟，孙震，张荃，冯月君，李勇，刘琳，齐向武，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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