快速检测微量百菌清的试纸条制造技术

本实用新型专利技术涉及一种快速检测微量百菌清的试纸条。该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中纤维素膜层上有用偶联百菌清的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体溶液印制的对照印迹。金标抗体为胶体金标记的百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。偶联百菌清的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。本实用新型专利技术的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，检测成本低，适用范围广，易于推广应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种检测微量抗菌类药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量百菌清的试纸条。
技术介绍
百菌清(chlorothalonil, CTN),化学名称为2，4, 5, 6_四氯-1，3_苯二腈，分子式为C8N2Cl4，分子量为265. 91，是一种高效的非内吸性广谱有机氯杀菌剂，对多种作物的真菌病害有良好的预防作用，被广泛应用于蔬菜、果树、豆类、水稻、小麦、森林等多种作物的病害防治，工业上用作防霉涂料添加剂。因为百菌清对植物体具有良好的黏着性，导致百菌清及其代谢产物在果蔬、土壤及水中均有较大残留，直接对生态环境和人类健康造成严重危害。同时百菌清对鱼类和两栖动物也有较大的毒性，能使水生生物、两栖生物发生遗传性突变。百菌清在自然界中的主要代谢物质之一 3-羟基-2，4，5-三氯间苯二腈(TPN-OH),其毒性是母体毒性的30倍，其移动性和持久性也远大于母体，它的毒性正引起人们的重视。我国2010年新颁布的《食品中百菌清等12种农药最大残留限量》中规定，番茄和黄瓜中百菌清的最大残留限量为5mg/kg，据报道，35种在蔬菜上常检出超标的农药中，百菌清的检出超标次数列第8位。因此急需建立一种快速、灵敏、有效的百菌清残留检测方法。目前国内外检测百菌清残留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)等，这些方法检测百菌清需经一系列复杂的处理净化过程，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，同时需要大型专门的仪器设备和专业技术人员操作，无法现场检测，时效性较差。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度较高，分析过程相对简单，用作百菌清的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，但目前百菌清免疫学快速检测方法在国内外尚属空白，急待研究解决。
技术实现思路
本技术要解决的技术问题提供一种特异性强、灵敏度高、快速、简便的快速检测微量百菌清的试纸条。本技术的技术方案—种快速检测微量百菌清的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上设有偶联百菌清的载体蛋白印制的检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹，所述金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附百菌清的金标抗体玻璃纤维棉制成。所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。所述偶联百菌清的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“T T”字型排列印迹，或为“丄丄”字型排列印迹，或为“ h卜，，字型排列印迹，或为”字型排列印迹。在吸附纤维层、金标抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧O. 3 O. 7cm处印制有样品标记线。本技术的试纸条具有以下优点(I)特异性强，灵敏度高。本技术试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷 间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，检测试纸条具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到纳克级的微量百菌清。本技术在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义。φ简便、快速。使用本技术的试纸条，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。只需将试纸条插入被检样品中10 20秒，取出后5分钟内即可判定检测结果。S:结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示棕红色“ I ”(或“十”、“”)印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“ I ”印迹，表示被检样品中含有百菌清，显示两条棕红色“ I I ”印迹，表示被检样品中不含百菌清。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。φ节省费用。使用该检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。使用该检测试纸条，每份样品仅需人民币3 5元，比用通常的仪器分析(每份样品300元左右)和进口 ELISA试剂盒(每份样品30元左右)的费用大幅下降。:f;适用范围广，便于推广应用。本技术的检测试纸条操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，具有广阔的市场前景和明显的经济效益以及社会效益。附图说明图I为百菌清试纸条的结构示意图；图2为百菌清试纸条的俯视结构示意图。具体实施方式要制成快速检测微量百菌清试纸条，首先制备偶联百菌清载体蛋白和百菌清金标抗体，从而制备隐形检测印迹和金标抗体纤维层；其次制备羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体，用于制备隐形对照印迹。(I)百菌清载体蛋白偶联物抗原的制备采用羰基二咪唑法，将百菌清与载体蛋白进行偶联，制备人工结合抗原。称取百菌清IOmg和氟化钾3mg溶入400μ1乙二醇溶液中(加入氟化钾能使乙二醇更易与百菌清反应，取代百菌清分子上的6位氯原子，得到半抗原羟基百菌清(CTN-0H))，加热至90 100°C，磁力搅拌反应24 30h ;反应结束后将反应液冷却至室温，加入到5g冰水中，将产生的沉淀分离并风干，得白色固体即百菌清衍生物CTN-OH (羟基百菌清)；用400μ N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解百菌清衍生物，并加入4mg N，N-羰基二咪唑(⑶I)，磁力搅拌反应3h,然后加入含IOmg载体蛋白BSA(半抗原和载体蛋白分子的摩尔比为200 300: 1，载体蛋白可用相同摩尔数的OVA或KLH替代)的PBS溶液(PBS溶液浓度为O. Olmol/L, pH=7. 4左右),搅拌反应过夜；用PBS透析3天,然后离心,弃沉淀,得到百菌清的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20°C，备用。(2)抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体的制备单抗制备用制备的百菌清载体蛋白偶联物以2(^g 5(^g/只的用量免疫6 8周龄Balb/C小鼠3 4次，每次免疫间隔时间3 5周，确定抗体效价符合要求后进行超强免疫，并在融合之前检测其抑制价，之后3 4天将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，IOOOrpm离心lOmin，收集脾细胞。将I X IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，IOOOrpm离心IOmin弃上清，将细胞沉淀物于37°C水浴中缓缓加 入O. 7 I. OmL的50%PEG4000, Imin内加完，前30秒加O. I O. 3mL，中间15秒加O. 2 O. 4mL，最后15秒加完；然后缓缓加入无血清164本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测微量百菌清的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上设有偶联百菌清的载体蛋白印制的检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹，所述金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测微量百菌清的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上设有偶联百菌清的载体蛋白印制的检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹，所述金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附百菌清的金标抗体玻璃纤维棉制成。3.根据权利要求I所述的试纸条，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓瑞广，职爱民，胡骁飞，邢广旭，王玲玲，张改平，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：实用新型
国别省市：