基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条制造技术

本实用新型专利技术公开一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条，试纸条含有支撑层、吸附层、保护层，吸附层包括吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的检测印迹以及用羊抗小鼠IgG抗体印制的对照印迹；荧光抗体采用NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。本实用新型专利技术实现了基于上转换荧光纳米材料标记的免疫层析技术在定量检测CL残留中的应用，使CL残留检测无本底干扰；该试纸条特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广，易于推广应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条
本技术涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种以上转换荧光材料作为生物标记物的用于定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条。
技术介绍
克伦特罗(ClenbuteroI, CL),俗称“瘦肉精”，盐酸克伦特罗是其盐酸盐，具有促进肌肉发育和脂肪分解作用，克伦特罗可以提高肉用动物的胴体瘦肉率。因为消费者对瘦肉的特殊偏好，瘦肉产出率高的猪可以卖个好价钱，添加“瘦肉精”给养殖户带来了额外收益。 因此，受不法利益的驱使，养殖户常在养殖环节添加“瘦肉精”到动物饲料中去。但是克伦特罗是一种选择性β 2-肾上腺素受体激动剂，副作用极大，当摄入量较大时会造成心血管系统的损害和严重的神经症状。当人们食用了含克伦特罗残留的动物内脏和肉品后，会造成急性或慢性食肉中毒，危害消费者的健康。目前为止没有一个国家批准“克伦特罗”可用于动物生产中，但长期以来一直存在着非法使用的情况，在世界各地造成严重食物中毒的事件并不鲜见。近年来在我国多个城市也出现了“瘦肉精”中毒事件，极大地威胁着消费者的身心健康。用于克伦特罗残留检测的方法较多，主要有(I)理化分析法，如高压液相色谱仪、 气相色谱、薄层层析、电泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；(3)生物测定法，如微生物学测定法、放射受体测定法等。但这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，检测时间较长，限制了其应用范围，难以在实际生产中推广应用。免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作“瘦肉精”的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术。上转换荧光技术(UPT)，是一种具有高灵敏度、基于上转磷光体(UCP)的新型生物检测技术， UCP具有独特的物理结构和光学特性，是一种完全惰性的无机发光材料，经过表面修饰与活化后，可作为新型标记物在生物检测领域应用。经检索，用于检测食品中农药、兽药残留的 UCP免疫层析试纸未见报道，虽然胶体金试纸在此方面应用较广，但其不能做到定量检测， 作为更敏感、稳定、灵活、安全的UPT-LF的研究，是胶体金免疫检测技术的有力补充，亟待加强该方面的研究和探讨。
技术实现思路
本技术要解决的技术问题针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、 快速、简便、能定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条。本技术的技术方案一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋3白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹。所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用 NaYF4: Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。所述NaYF4:Yb:Er纳米颗粒是以NaYF4为基质、Yb3+为敏化剂，由Yb和Er共掺杂形成的直径为50-200nm的纳米颗粒。所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜； 偶联CL的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“T T”字型排列印迹，或为“丄I”字型排列印迹，或为“卜卜”字型排列印迹，或为H ”字型排列印迹。在所述吸附纤维层、荧光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与荧光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧 O. 3-0. 7cm。本技术的积极有益效果(I)特异性强，灵敏度高。本技术试纸条以上转换荧光纳米材料NaYF4:Yb:Er 标记CL抗体为基础制成,能在红外光下直接观测结果，由于NaYF4:Yb:Er纳米颗粒的非凡光学特性，使CL的检测消除了背景光的干扰，灵敏度大大提高，最低可检测到匹克级的痕量残留。(2)稳定性高，灵活性好。试纸条中UCP的发光现象是由于其结构内部的纯粹物理过程产生的，完全避免了来自检测样品腐蚀以及自身衰变导致的发光淬灭 ；UCP具有的可自由组合的多样化特征光谱(吸收光谱和发射光谱)使其能适用于多重分析。(3)安全性好。试纸条中的上转换荧光纳米材料具有无机惰性、红外光激发、可见光发射的特点，使得基于UCP的检测对于检测者、被检测品和环境均无任何危害。(4)简便、快速。试纸条可对全血、尿液、唾液、组织匀浆等进行直接检测，无须进行样品的预处理。使用本技术试纸条借助荧光阅读器可直接读值，实现定量检测，可现场操作。只要将试纸条插入被检样品10 20秒钟，5分钟内即可判定检测结果。(5)结果显示形象、直观、准确。本技术试纸条以显示红色“ I ”和“ Il ”(或 “十”、“丁”、“丄”、“”)印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条红色“ I ”印迹，表示被检样品中含有CL;显示两条红色“ Il ”印迹，表示被检样品中不含CL。 此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。(6 )适用范围广，便于推广应用。本技术实现了基于上转换荧光纳米材料标记的免疫层析技术在定量检测CL残留中的应用，使CL残留的检测无本底干扰；该试纸条操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等。本技术在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。附图说明图I为本技术的免疫层析试纸条的结构示意图；图2为本技术的免疫层析试纸条的俯视结构示意图。具体实施方式本技术的试纸条制备过程包括CL单克隆或多克隆抗体的制备、荧光抗体纤维层(结合垫)的制备、吸附纤维层(样品垫)的制备、纤维素膜层(分析膜)的制备和试纸条的组装等步骤。I、CL单克隆抗体或多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备包括CL免疫原的制备、免疫动物(小鼠)、细胞融合、单克隆抗体的师选、单克隆抗体的制备；多克隆抗体的制备包括CL免疫原的制备、免疫动物(兔子)、多克隆抗体的筛选、多克隆抗体的制备。(I)CL人工抗原的制备将100 mg CL标准品溶于10mL、lmol/L的盐酸，缓慢滴加30%的NaNO2溶液，用淀粉KI试纸检测，加到KI试纸为棕紫色时停止滴加，搅拌反应45 min,滴加5%的氨基磺酸铵溶液，用淀粉KI试纸检测其反应终点。用滴管将偶氮化的CL溶液缓慢滴加于溶有300 mg BSA的PBS(pH7.4)中，并用I mol/L的NaOH溶液调节pH值至9. 0，4°C避光反应24 h后， 4°C透析48 h，分装，-20°C保存备用。同理制备包被原。(2) CL单克隆抗体的制备用制得的CL人工抗原以5(^g IOOPg/只的用量免疫6 8周龄BALB/c小鼠 3 4次，每次免疫间隔3 5周，确定抗体效价本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于：在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹。

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹。2.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征是所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。3.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征是所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，职爱民，宋春美，胡骁飞，杨继飞，赵东，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：实用新型
国别省市：