本发明专利技术提供了一种检测生物体内组织邻苯二甲酸二丁酯（DBP）相对含量的方法。利用DBP人工抗原免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，用DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布。本发明专利技术还可以通过图像分析软件分析荧光强度，从而计算DBP的含量。本发明专利技术对DBP的含量和分布可以进行可视化分析，灵敏度高，方便快捷，稳定性好，成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物技术 领域。
技术介绍
近年来在许多国家和地区，塑化剂对食品、环境的污染引起了人们强烈的担忧。邻 苯二甲酸二丁酯(DBP)属于苯二甲酸酯类化合物，被普遍应用于塑料制品、胶水、油漆、指 甲油、洗发水和沐浴液等数百种产品中。邻苯二甲酸二丁酯是半挥发性化合物，不与终产品 共价结合，在生产和生活中，被不断地释放到大气、土壤和水环境中。环境中的邻苯二甲酸 二丁酯又通过呼吸、饮食、皮肤接触等三种途径进入人体。因此，人类正面临着越来越高的 邻苯邻苯二甲酸二丁酯暴露风险。有研究报告指出我国普通人群DBP日摄入量为12. 2ug/ kg bw,高于世界平均水平。动物模型研究和流行病学调查发现邻苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖发育的 障碍。邻苯二甲酸酯还具有免疫毒性，能导致儿童产生哮喘、湿疹、鼻炎等持久性过敏症。此 外，邻苯二甲酸二丁酯还能能导致糖尿病、肥胖症等。因此，邻苯二甲酸二丁酯检测已成为食品安全、环境监测、毒理学研究等领域的重 要工作。由于邻苯二甲酸二丁酯在水环境、生物体内的含量较低，常常在检测域以下，因此 邻苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困难的工作。早期用含同位素14C的DBP饲喂实验动物，然后检测体内组织中的放射性水平来评 价DBP的水平。但是由于DBP在生物体内降解快，所检测到的放射量只是DBP和降解代谢 物的总体水平，并不能代表DBP在生物组织内的真正含量。现在DBP的分析多采用气相色谱(GC)、HLPC、GC-质谱联用法等色谱分析技术， 但这些技术需要进行样品前处理等，耗时多，并且有较高的仪器要求，色谱柱等耗材价格昂 贵，此外，还需要操作人员有丰富的经验。免疫分析由于选择性强、灵敏度高，一次可检测多种样品，因此把免疫分析技术应 用于DBP检测具有简便、快速、成本低的优点。张明翠等用一种DBP的多克隆抗体，通过免疫 组化法分析了水和包装的食品中DBP的含量。Yanaihara等运用酶联免疫分析法(ELISA) 分析了邻苯二甲酸酯类物质的含量。但是，这两个研究都是基于多克隆抗体的免疫分析。多 克隆抗体对抗原的专一选择性、灵敏度上都不及单克隆抗体。多克隆抗体受限于实验动物， 不能无限制的获取。此外，由于从不同动物个体中获取的多克隆抗体的选择性、灵敏度、效 价等都不同，因此用多克隆抗体建立同一标准的免疫分析方法就很困难。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供操作简便、灵敏度高的检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法。本专利技术利用DBP结构类似物作为半抗原连接载体蛋白OVA而制得人工抗原，该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体。取待测生物组织样品制成冰冻切片，用该 DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布。通过图像分析软件IPP分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。本专利技术所采用的技术方案是(O利用DBP结构类似物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)作为半抗原连接载体蛋白 OVA而制得人工抗原，用该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合，而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体；(2)取待测生物组织样品制成冰冻切片，用(I)所得DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布；(3)通过图像分析软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。本专利技术将单克隆抗体技术、免疫荧光技术和图像分析软件技术相结合。更具体地， 可采用如下步骤O用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化，通过小鼠腹水法大量制备单克隆抗体，再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP 单克隆抗体；2)抗体效价检测；3)载玻片预处理将载玻片用王水浸泡过夜，大量流水冲洗干净并晾干，再在DEPC水配制的多聚赖氨酸溶液中浸泡30min，室温晾干备用；4)生物组织材料切片和封闭取待测生物组织样品用4%PFA固定I小时，再用液氮冰冻并用OCT包埋样品，用冰冻切片机 在_20°C下将包埋样品切成5-10 μ L薄片，将冰冻切片贴于载玻片上在37°C烘干lh，冷却至室温，在卧式染缸中用PBS将载玻片洗3次，每次 IOmin ;用5%的溶于PBS的奶粉在室温下封闭Ih ；5)DBP单克隆抗体结合DBP :用PBS冲洗载玻片洗去牛奶，加入DBP单克隆抗体孵育， 每片加200yL 1%溶于PBS的奶粉，按1:100比例稀释DBP单克隆抗体，4°C孵育过夜；取出玻片，放入卧式染缸用PBST (PBS+0. l%Tween-20)在摇床上洗5次，每次IOmin;再用PBS 在摇床上洗3次,每次IOmin;6)二抗标记DBP单克隆抗体加入二抗和PI孵育液(1:100稀释FITC-标记羊抗鼠血清，lOyg/ml PI，2%正常羊血清，溶于PBS)黑暗中室温孵育lh;取出玻片，放入卧式染缸用 PBS在摇床上洗6次，每次IOmin;7)用抗淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜观察并拍照，使用图像软件分析荧光强度， 从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。比较分析各样品DBP含量时，显微镜的波长等参数应一致。本专利技术对DBP含量和分布可以进行可视化分析，灵敏度高，方便快捷，稳定性好， 成本低廉，且由于本专利技术的单克隆抗体对DBP特异性强，因此检测结果不受其它酞酸酯的影响。本专利技术可以广泛适用于检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯的含量，评价环境中邻苯二甲酸二丁酯的污染水平。附图说明图1显示的是将大鼠通过皮肤涂抹400mg/kg/d DBP染毒五天后，取皮肤组织制成 冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在皮肤组织内的分布。上排为DBP染毒组左为FITC绿色突光显示DBP的分布；中为PI染色显示细胞 核；右为前两者的融合照片。下排为未染毒对照组左为FITC绿色荧光显示DBP;中为PI染色显示细胞核；右 为前两者的融合照片。图2显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小时 内取肾组织制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在肾组织内 的分布。上排为DBP染毒组左为FITC绿色突光显示DBP的分布；中为PI染色显示细胞 核；右为前两者的融合照片。下排为未染毒对照组左为FITC绿色荧光显示DBP;中为PI染色显示细胞核；右 为前两者的融合照片。图3显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小时 内取肾、肝、胃、睾丸组织制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP 在各组织内的分布，再通过IPP软件分析激光共聚焦照片的荧光强度而计算DBP的相对含量。图4显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒 结束后的24小时、48小时、72小时采集肾组织样品制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗 体的免疫荧光技术分析DBP在肾组织内的分布，再通过IPP软件分析激光共聚焦照片的荧 光强度而计算DBP的相对含量。图5显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法，其特征在于：（1）利用DBP结构类似物4?氨基邻苯二甲酸二丁酯作为半抗原连接载体蛋白OVA而制得人工抗原，用该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合，而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体；（2）取待测生物组织样品制成冰冻切片，用（1）所得DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布；（3）通过图像分析软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈明清，杨旭，曾强，魏晨曦，袁均林，丁书茂，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：
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