本发明专利技术提供了一种检测沙丁胺醇药物的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和背衬。在所述反应膜上有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，结合物释放垫包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述沙丁胺醇胶体金试纸卡检测沙丁胺醇药物的方法。本发明专利技术所提供的试纸卡可用于检测尿液、猪肉、鸡肉、鱼、虾、饲料样品中沙丁胺醇药物残留，具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，适合大量样本的筛查和现场监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
沙丁胺醇是一种强效选择性β -受体兴奋剂药物，临床上常用于治疗支气管哮喘、哮喘性支气管炎和肺气肿患者的支气管痉挛等呼吸系统疾病。因此药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康极有危害，我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β -兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食品动物。目前，对于沙丁胺醇的残留检测主要有高效液相色谱法、液相色谱 质谱联用分 析法、气相色谱法、毛细管区带电泳法、免疫测定法等检测方法，仪器检测方法具有检测精确度高的优点，但其仪器化程度高，样品处理较复杂、检测费用高等，不适合用作大批样品的检测，免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、成本低的沙丁胺醇药物残留检测胶体金试纸卡及其检测方法。本专利技术所提供的检测沙丁胺醇药物残留的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，所述反应膜上有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物。上述反应膜上检测线处包被的沙丁胺醇-载体蛋白偶联物由沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物中的沙丁胺醇单克隆抗体由沙丁胺醇-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。本专利技术中包被原、免疫原、单克隆抗体的合成过程为1.半抗原合成(I)取l-3g沙丁胺醇，溶入20-50ml DMF中，然后加入10%摩尔当量的TEMPO和10%摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml O. 5M的NaHCO3水溶液，室温下搅拌30分钟后，力口Al. 1-1. 5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，除去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，除去溶剂后柱层析纯化，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物。(2) l-2g步骤(I)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20-30ml DMF中，加入2-5摩尔当量的乙二胺，室温至100°C反应5-20小时，除去溶剂，乙醇-水中重结晶，得到白色固体，为沙丁胺醇单氧化物的乙二胺缩合产物，即为沙丁胺醇半抗原。2.免疫原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原18mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8yl加入(I)中，室温下搅拌反应18h。(3)取BSAlOOmg用5. 5ml水稀释后加入上述溶液中。(4)反应 24h 后加入 24mgNaBH4 反应 2h。(5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。3.包被原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原15mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8yl加入(I)中，室温下搅拌反应18h。(3)取0VA30mg用4. 5ml水稀释后加入上述溶液中。(4)反应 24h 后加入 24mgNaBH4 反应 2h。(5)用三蒸水透析48小时，即得包被原。4.单克隆抗体的制备动物免疫沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。细胞融合与克隆化取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供了一种制备上述胶体金试纸卡的方法，主要包括如下步骤(I)制备包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；(2)制备具有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线的反应膜；(3)将(I)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。具体的说，步骤包括I)制备获得沙丁胺醇半抗原；2)将沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联，制备沙丁胺醇包被原和免疫原；3)用沙丁胺醇免疫原免疫小鼠,将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；6)将制备的沙丁胺醇单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物；7)将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为O. 5% )和pH7. 2,0. 5mol/L磷酸盐缓冲液中浸湿lh，37°C烘3h备用，然后将沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物包被到结合物释放垫上；8)将沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；9)将样品吸收垫置于pH为7. 2，含小牛血清2%，I %活性剂，O. 02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C下烘干2h后备用；10)将上述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序黏贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T)线和质控区(C)线均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测区位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控区位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3_宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡，2 8°C条件下保存12个月。本专利技术还提供了一种应用上述胶体金试纸卡检测沙丁胺醇的方法，包括的步骤有(I)样品的前处理尿液样品尿液样品必须收集在洁净干燥，不含任何防腐剂的塑料尿杯或玻璃容器中。若不能及时送检，尿样在2-8°C冷藏可保存4小时，长期保存需冷冻-20°C，严禁反复冻融。检测前尿样需回温到室温，如尿样浑浊，需3000rpm以上离心5min后检测。猪肉、鸡肉、鱼肉、虾等组织取去脂肪组织样品于均质器中均质lmin (lOOOOrpm)，称取一定量(1. Og)均质的组织样品到4ml离心管中，加入样品提取液(含O. 8%的氯化钠的pH7. 2的O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液)200 μ 1，涡动Imin ;放入80_100°C水中水浴15min，取出冷却至室温，待检。饲料研碎饲料样品，称取1. Og饲料样品到4ml离心管中，加入Iml乙腈，涡动lmin，静置5min ;移取50 μ I上清液至150 μ I样本稀释液(pH7. 2,0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液)中混勾待检。(2)用胶体金试纸卡检测用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3 4滴(约80 μ I)于加样孔，反应lOmin，根据示意图判定结果。(3)分析检测结果本专利技术将沙丁胺醇-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜上检测线处，结合物释放垫上含有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物，在层析过程中样品中残留的沙丁胺醇药物和反应膜上预包被的偶联抗原竞争胶体金标记的沙丁胺醇单克隆抗体，通过检测线是否显色判断样品中是否有沙丁胺醇药物的残留，当检测线(T线)和质控线(C线)都显色时为阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测沙丁胺醇药物的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，其特征在于所述反应膜上有包被有沙丁胺醇?载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有沙丁胺醇单克隆抗体?胶体金标记物。
【技术特征摘要】
1.一种检测沙丁胺醇药物的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，其特征在于所述反应膜上有包被有沙丁胺醇-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物。2.如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述的沙丁胺醇-载体蛋白偶联物由沙丁胺醇半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的沙丁胺醇单克隆抗体-胶体金标记物中的沙丁胺醇单克隆抗体由沙丁胺醇-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。3.如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述的沙丁胺醇半抗原的制备方法主要包括如下步骤(1)取l_3g沙丁胺醇，溶入20-50mlDMF中，然后加入10%摩尔当量的TEMPO和10%摩尔当量的四丁基氯化铵，20-50ml O. 5M的NaHCO3水溶液，室温下搅拌30分钟后，加入1.1-1. 5摩尔当量的NCS，室温反应2-5小时后，出去大部分溶剂，乙酸乙酯萃取，洗涤，...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，罗晓琴，朱亮亮，崔海峰，汤庆彩，崔彦虎，张荃，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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