一种检测蚕砂中氯霉素含量的方法及其样品前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蚕砂中氯霉素含量的方法及其样品前处理方法。前处理方法包括：(1)将蚕砂样品溶于水，并加入乙酸乙酯进行氯霉素的提取；(2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl，分层，收集上层得第一上清液；(3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；(4)将所述第二上清液浓缩、复溶得复溶液；(5)将所述复溶液经固相萃取小柱进一步净化；(6)将所述净化后的溶液经浓缩、复溶和过滤步骤，得到待测样液。本发明专利技术还公开了样品经前处理后通过液-质联用检测氯霉素含量的方法。该方法基质干扰小、检出限低、灵敏度高、重现性好的特点，且适于对禁用物质氯霉素的痕量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蚕砂中氯霉素含量的方法及其样品前处理方法
本专利技术属于食品检测领域，具体涉及一种检测蚕砂中氯霉素含量的方法，以及适用的样品前处理方法。
技术介绍
氯霉素(chloramphenicol，CAP)属广谱抗生素，对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用，曾广泛用于畜禽疾病的防治。但临床研究已证实，氯霉素有较强的毒副作用，会造成骨髓造血功能的抑制毒性、神经毒性、遗传毒性等，还会产生灰婴综合征。此外，长期微量摄入氯霉素，会造成沙门氏菌、大肠杆菌的耐药性，引起机体正常菌群失调，使身体易患各种疾病。因此很多国家禁止其在动物饲养和治疗中使用，并规定在动物性食品中不得检出氯霉素。我国2002年农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中也明确规定氯霉素禁止使用，在动物性食品中不得检出。蚕砂，也叫蚕沙，为蚕蛾科昆虫家蚕的干燥粪便,具有祛风除湿，活血定痛之功效，是我国传统特色中药材，在历代本草多有收录。同时，蚕砂中含有一系列丰富的营养物质和药用成分，如叶绿素、类胡萝卜素、植醇、三十烷醇、果胶、叶蛋白等，常被用作提取原料用于食品、饮料、化妆品、医药等领域。此外，蚕砂富含各族维生素及烟酸，可预防畜禽有关维生素缺乏症和治疗眼疾、贫血、白肌病等，还被用作猪、羊、禽、鱼等动物饲料。近年来，蚕砂在食品药品、动物饲料等方面的开发利用日益广泛，但蚕砂中蚕药残留问题还未引起重视。在家蚕饲养中，细菌病为常见病害，一直以来，蚕农沿用添食氯霉素来防治，具有显著的预防和治疗效果。但氯霉素残留毒副作用大，我国已在包括家蚕的所有动物饲养过程中禁用，然而实际饲养中仍然存在严重的滥用现象，造成蚕砂中氯霉素残留，并通过食物链传递，给消费者的健康带来一定的潜在危害。为了保护蚕砂产业的良性发展、保障消费者的健康，亟需开发出一种蚕砂中氯霉素残留量的测定方法，对蚕砂进行监测管理，预防氯霉素的污染。目前，国内外文献中还未见蚕砂中氯霉素检测的报道，基于氯霉素的检测方法大多仅限于动物源食品及饲料，样品基质相对简单，干扰较小，较易测定。而蚕砂成分复杂，若采用现有食品或饲料中氯霉素残留检测的方法，容易出现假阳性和假阴性结果。因此，亟需开发出一种新的适用于蚕砂中氯霉素检测的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的高效灵敏的样品前处理的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服目前还没有适用于蚕砂中氯霉素检测的样品前处理技术，因而提供一种检测蚕砂中氯霉素含量的样品前处理方法，该方法通用性强，能有效提取、净化样品，适用于氯霉素含量测定中的样品前处理，尤其适用于液-质联用检测氯霉素含量的样品前处理。本专利技术的另一个目的是提供一种能够快速检测蚕砂中氯霉素含量的方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种检测蚕砂中氯霉素含量的样品前处理方法，其包括下述步骤：(1)将蚕砂样品溶于水，并加入乙酸乙酯进行氯霉素的提取；(2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl，涡旋，离心，收集上层得第一上清液；(3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；(4)将所述第二上清液浓缩、复溶得复溶液；(5)将所述复溶液经固相萃取小柱进一步净化；(6)将所述净化后的溶液经浓缩、复溶和过滤步骤，得到所需的待测样液。所述步骤(1)中，所述乙酸乙酯提取氯霉素的步骤是在超声条件下进行的，优选的，超声的频率为40kHz，提取时间为20-30min。所述步骤(1)中，所述蚕砂样品与水的质量比为1:3-1:6，所述水与乙酸乙酯的体积比为1:2-1:4。所述步骤(2)中，所述MgSO4的添加量与所述蚕砂样品的质量比为1:1-3:1，所述NaCl的添加量与所述蚕砂样品的质量比为0.5:1-1:1。所述步骤(3)中，所述吸附剂为粒径120-140目的GCB吸附剂。所述吸附剂的添加量与所述蚕砂样品的质量比为0.4:1-0.6:1。所述步骤(4)中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。所述复溶步骤是采用水溶液。所述步骤(5)中，所述固相萃取小柱为HLB固相萃取小柱，或相当者。使用前依次用甲醇和水活化，复溶液过柱，控制流速1滴/3～4s，用水淋洗，抽干，用甲醇洗脱，收集洗脱液。所述步骤(6)中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。所述复溶步骤是采用水溶液。所述过滤采用孔径为0.22μm滤膜。进一步地，本专利技术还提供一种液-质联用检测蚕砂中氯霉素含量的方法，其包括下述步骤：(a)按照上面所述的样品前处理方法对蚕砂样品进行前处理，得到所需的待测样品；(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对蚕砂中含有的氯霉素进行检测。进一步地，步骤(b)中，所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：ThermoHypersilGoldC182.1×50mm，1.9μm；柱温：30℃；流动相A：甲醇，流动相B：水；流速：0.40mL/min；进样量：10μL；洗脱方式：梯度洗脱；所述三重四级杆质谱的检测条件为：质量分析器：三重四级杆；离子源：ESI-；喷雾电压：2.5kV；鞘气流速：35arb；辅助气流速：5arb；毛细管温度：270℃。所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：Time(min)A(％)B(％)010900.510902.580203.080203.110905.01090本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术所述的样品前处理方法，以乙酸乙酯对样品进行氯霉素的提取后，以MgSO4和NaCl对样品进行分层提取，利用水中盐浓度的增加，进一步降低氯霉素在水相中溶解度，进而增加其在有机相中的溶解浓度，使其通过液液分配而更多的进入有机相，最大化的增加氯霉素的提取效率；同时由于MgSO4在水中的溶解度较小，并具有很强的吸水性，且在吸水的同时产生自发热，能够进一步增加氯霉素在有机相中的溶解度，从而提高提取效率。(2)本专利技术所述的样品前处理方法，当称取蚕砂样品的质量为1g时，所述MgSO4的用量为1-3g，并优选2g，既避免了MgSO4用量太少，导致吸水及放热效应比较弱，起不到提高提取效率的问题，也避免了MgSO4用量太大，将会产生大颗粒状的结块，导致MgSO4与样品基质分散不均匀，影响提取效率的问题；所述NaCl的用量为1g，若NaCl用量太少，导致盐析作用不明显，不利于有机相与水相分层，降低分离效率。(3)本专利技术所述样品前处理方法，利用吸附剂GCB对样品进行净化处理，从而能够有效除去待测样品中的叶绿素等色素，解决了现有技术对蚕砂样品净化不完全，检测中易出现杂质干扰的问题。当称取蚕砂样品的质量为1g时，所述GCB的用量为0.4-0.6g，并优选0.5g，既避免了GCB用量太少，净化效果不明显，也避免了GCB用量太大，对目标分子产生吸附，回收率降低；(4)本专利技术所述样品前处理方法，利用HLB固相萃取小柱对样品进行进一步的净化处理，从而能够除去待测样品中一些极性分子以及一些与氯霉素分子量相近的干扰分子，此外还能除去在提取过程中引进的盐析剂NaCl和MgSO4，避免盐进入到液-质联用仪中，抑制质谱响应信号及缩短色谱使用寿命。(5)本专利技术所述浓缩步骤采用氮气吹干的方式，不仅可以同时对多个样品进行浓缩处理，效率较高，而且相较于旋转蒸发的方式，氮气吹干更适用于少量样品，并避免了样品在转移中的浪费而造成的实验误差。(6)本专利技术所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测蚕砂中氯霉素含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：(1)将蚕砂样品溶于水，并加入乙酸乙酯进行氯霉素的提取；(2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl，涡旋，离心，收集上层得第一上清液；(3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；(4)将所述第二上清液浓缩、复溶得复溶液；(5)将所述复溶液经固相萃取小柱进一步净化；(6)将所述净化后的溶液经浓缩、复溶和过滤步骤，得到待测样液。

【技术特征摘要】
1.一种检测蚕砂中氯霉素含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：(1)将蚕砂样品溶于水，并加入乙酸乙酯进行氯霉素的提取；所述蚕砂样品与水的质量比为1:3-1:6，所述水与乙酸乙酯的体积比为1:2-1:4；(2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl，涡旋，离心，收集上层得第一上清液；所述MgSO4的添加量与所述蚕砂样品的质量比为1:1-3:1，所述NaCl的添加量与所述蚕砂样品的质量比为0.5:1-1:1；(3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；所述吸附剂为GCB吸附剂，所述吸附剂的添加量与所述蚕砂样品的质量比为0.4:1-0.6:1；(4)将所述第二上清液浓缩、复溶得复溶液；(5)将所述复溶液经固相萃取小柱进一步净化；所述固相萃取小柱为HLB固相萃取小柱；(6)将所述净化后的溶液经浓缩、复溶和过滤步骤，得到待测样液。2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙酸乙酯提取氯霉素的步骤是在超声条件下进行的，超声的频率为40kHz，提取时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔凤云，张朝晖，刘萤，严华，云环，李建辉，刘鑫，齐鹤鸣，何悦，许翔，
申请(专利权)人：北京市检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11