本发明专利技术公开了一种β‑兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法。是首先将量子点与β‑兴奋剂单克隆抗体偶联，得到量子点与β‑兴奋剂单克隆抗体的标记复合物，即为量子点荧光探针；再将该标记复合物作为量子点荧光探针与待测样品混匀孵育后，利用免疫层析试纸条进行β‑兴奋剂残留的检测。本发明专利技术能够实现对多种β‑兴奋剂类药物的同时快速筛查，检测方法简便、快捷、结果准确、灵敏度高，可做定性、定量检测，价格低廉，适用范围广，具有很好的推广应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全免疫检测
更具体地，涉及一种β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法。
技术介绍
β-兴奋剂是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去肾上腺素的苯乙胺类药物。β-兴奋剂在临床上常用于防治人、畜的支气管痉挛和哮喘等病症。大剂量的β-兴奋剂能影响营养物质在动物体内的重新分配，加快脂肪的分解代谢，增加蛋白质的合成，显著提高瘦肉率。因此，β-兴奋剂曾被作为饲料添加剂广泛用于畜牧生产中。但是，β-兴奋剂在动物内脏蓄积严重，能通过食物链进入人体，使人出现心悸、头晕、心律失常等症状，严重时甚至会导致死亡。我国农业部2002年发布的第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》明确规定克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯类不得检出。由于近年来世界各地陆续发生食用残留克伦特罗的动物性食品的中毒事件，使得各国均加强了对克伦特罗的监督检测，它的非法使用受到了极大的限制，不法分子不得不去寻找新的替代品。莱克多巴胺、沙丁胺醇等成为克伦特罗最常用替代品，而其他β-兴奋剂如马布特罗和溴布特罗等在20世纪90年代后才上市，相对用得较少。β-兴奋剂残留的检测一直是食品安全的重点，目前关于β-兴奋剂的多残留检测方法很多，包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、酶联免疫法（ELISA）等方法。虽然这些方法灵敏度高、特异性好、精确度高，但是这些方法需要专业实验人员、大型实验仪器和繁琐的样品预处理，难以满足高通量、现场快速检测的需要，很难适应许多场合快速检测的需要。近年来，免疫层析检测技术因其快速、方便，适用于现场筛查，被广泛应用于β-兴奋剂类药物的快速检测。但是，目前已报道的免疫层析试纸条都只能检测一到两种β-兴奋剂药物，不能同时对多种β-兴奋剂进行筛查，而且只能实现定性检测，很难对检测样品进行定量分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种检测限低、灵敏度高，能够实现对多种β-兴奋剂类药物的同时快速筛查的方法；同时改进免疫层析系统，获得灵敏度高、稳定性好、低成本、可用于现场快速筛查测定食品中β-兴奋剂类药物的检测方法。本专利技术的目的是提供一种β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法。本专利技术另一目的是提供所述方法在检测β-兴奋剂残留方面的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，是首先将量子点与β-兴奋剂单克隆抗体偶联，得到量子点与β-兴奋剂单克隆抗体的标记复合物，即为量子点荧光探针；再将该标记复合物作为量子点荧光探针与待测样品混匀孵育后，静置反应1min，利用免疫层析试纸条进行β-兴奋剂残留的检测。优选地，所述量子点为水溶性羧基量子点。更优选地，所述量子点为水溶性羧基化核壳结构量子点，核壳结构为CdTe/ZnS。优选地，所述β-兴奋剂单克隆抗体为β-兴奋剂类广谱性单克隆抗体。更优选地，所述β-兴奋剂类广谱性单克隆抗体的制备方法如下：（1）抗原的制备：a.半抗原的合成将克伦特罗与戊二酸酐进行酰化反应，使克伦特罗分子结构上的醇羟基酰化成为含有5个碳的羧基间隔臂，并称之为β-兴奋剂类药物半抗原；b.免疫原的制备将β-兴奋剂类药物半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联得到免疫原；c.包被原的制备将β-兴奋剂类药物半抗原和牛血清白蛋白（BSA）采用混合酸酐法进行偶联得到包被原；上述β-兴奋剂的包被抗原为CL-BSA。（2）动物免疫：将上述制备的人工抗原免疫Balb/C小鼠，并采用间接ELISA方法测定其效价；（3）细胞融合：采用PEG融合法将能分泌抗体的小鼠脾脏细胞与能无限繁殖的瘤细胞进行融合；（4）杂交瘤细胞筛选：用间接ELISA检测培养液中的特异性抗体，进行效价和抑制率的测定，筛选出效价高和对药物抑制强的阳性杂交瘤细胞；（5）杂交瘤细胞亚克隆及建株：利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3~4轮，得到能稳定分泌均一抗体的杂交瘤细胞株；（6）单克隆抗体制备：采用动物体内诱生单克隆抗体法制备单抗。另外，作为一种优选的可实施方案，所述量子点荧光探针的制备方法如下：S1.取量子点溶解于磷酸盐缓冲液中，加入偶联剂和N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS），室温搅拌10～30min；所述偶联剂为1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；S2.再加入β-兴奋剂单克隆抗体，室温搅拌反应1～2h；S3.继续加入10% BSA溶液封闭反应0.8～1.2h，将反应液以10000～14000r/min离心30～50min；S4.离心后去除上清液，用复溶液复溶沉淀，得到量子点与β-兴奋剂单克隆抗体的标记复合物，4℃避光保存。其中，优选地，步骤S1所述量子点：1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）：N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS）的摩尔浓度比为1：3～6：13～17。更优选地，步骤S1所述量子点：1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）：N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS）的摩尔浓度比为1：5：15。即量子点和偶联剂的最佳比例为：n(QDs)：n(EDC)：n(NHS)= 1：5。优选地，步骤S1所述室温搅拌15min。优选地，步骤S1所述量子点与步骤S2所述β-兴奋剂单克隆抗体摩尔浓度比为1：3～6。更优选地，步骤S1所述量子点：步骤S2所述β-兴奋剂单克隆抗体=1：4。更优选地，步骤S2所述室温搅拌反应1.5h。另外，优选地，步骤S1所述磷酸盐缓冲液为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液。优选地，所述量子点：磷酸盐缓冲液：10% BSA溶液的用量的体积比为1：150～170：15～25。更优选地，所述量子点：磷酸盐缓冲液：10% BSA溶液的用量的体积比为1：160：20。优选地，步骤S3所述封闭反应1h。优选地，步骤S3所述离心为12000r/min离心40min。优选地，步骤S4所述复溶液为0.01mol/L、pH 7.4的Tris-HCl，其中包括0.5%的Tween-20和0.5%的BSA。进一步地，所述免疫层析试纸条包括底板、样品垫、反应膜、吸水垫，所述样品垫、反应膜和吸水垫依次贴附在底板上，所述反应膜上设置有包含β-兴奋剂包被抗原的检测线和包含羊抗鼠IgG抗体的质控线，且检测线位于样品垫一侧，质控线位于吸水垫一侧。其中，优选地，检测线上β-兴奋剂包被抗原的浓度为0.85mg/mL，所述质控线上羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.8 mg/mL。优选地，所述检测线和质控线相隔5mm。即作为一种优选的可实施方案，所述检测线和质控线的制备：以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定贴附在底板上，将β-兴奋剂的包被抗原用包被溶液配制成0.85mg/mL，羊抗鼠IgG抗体（即为羊抗鼠IgG二抗）用包被溶液配制成0.8 mg/mL，将β-兴奋剂包被原和羊抗鼠IgG抗体喷涂在反应膜上相应的检测区和控制区形成检测线和质控线，检测线和质控线相隔5mm，放置于37℃烘箱中干燥2h后备用，其中包被溶液为0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）。优选地，所述β-兴奋剂的包被抗原为CL-BSA。另外，优选地，所述底板为PVC。优选地，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β‑兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，是首先将量子点与β‑兴奋剂单克隆抗体偶联，得到量子点与β‑兴奋剂单克隆抗体的标记复合物，即为量子点荧光探针；再将该标记复合物作为量子点荧光探针与待测样品混匀孵育后，利用免疫层析试纸条进行β‑兴奋剂残留的检测。
【技术特征摘要】
1.一种β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，是首先将量子点与β-兴奋剂单克隆抗体偶联，得到量子点与β-兴奋剂单克隆抗体的标记复合物，即为量子点荧光探针；再将该标记复合物作为量子点荧光探针与待测样品混匀孵育后，利用免疫层析试纸条进行β-兴奋剂残留的检测。2.根据权利要求1所述的β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，所述量子点为水溶性羧基量子点。3.根据权利要求1所述的β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，所述量子点为水溶性羧基化核壳结构量子点，核壳结构为CdTe/ZnS。4.根据权利要求1所述的β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，所述β-兴奋剂单克隆抗体为β-兴奋剂类广谱性单克隆抗体。5.根据权利要求1所述的β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，所述量子点荧光探针的制备方法如下：S1.取量子点溶解于磷酸盐缓冲液中，加入偶联剂和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温搅拌10～30min；所述偶联剂为1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；S2.再加入β-兴奋剂单克隆抗体，室温搅拌反应1～2h；S3.继续加入10% BSA溶液封闭反应1h，将反应液以12000r/min离心40min；S4.离心后去除上清液，用复溶液复溶沉淀，得到量子点与β-兴奋剂单克隆抗体的标记复合物。6.根据权利要求5所述的β-兴奋剂多残留的量子点免疫层析试纸条快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述量子点：偶联剂：N-羟基琥珀酰亚胺溶液的摩尔浓度比为1：3～6...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨金易，曾道平，朱彬，
申请(专利权)人：广州万联生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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