本发明专利技术涉及一种分析肉制品的动物物种来源的方法。更具体地，本发明专利技术提供一种基于PCR‑RLFP‑DHPLC技术全景扫描分析食品中动物源性成份组成的方法。本发明专利技术还提供了一种用于分析肉制品的动物物种来源的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测领域。更具体地，本专利技术涉及一种分析肉制品的动物物种来源的方法。特别地，本专利技术提供一种基于PCR-RLFP-DHPLC技术扫描分析食品中动物源性成份组成的方法。本专利技术还提供了一种用于分析肉制品的动物物种成份的试剂盒。
技术介绍
国内外市场上肉制品掺假现象频发，这种假冒伪劣产品虽不至于损害人民群众的身体健康，但却足以侵害消费者利益，扰乱市场的公平竞争环境，极端情况下还会引发民族矛盾。因此，有必要研发肉制品中动物源性成分鉴定技术，对市场上“肉制品掺假”风险进行防控。目前国内外用于动物源性成分鉴定的主流技术为荧光实时定量PCR(real-time PCR)技术，虽然该技术具有检测灵敏度高、特异性好和耗时短等优势，但是利用该技术对动物源性成份进行鉴定时，检测结果只能显示样品中是否含有某种动物源性成份，而无法对样本中的动物源性成份组成进行全景分析。正是由于这种技术缺陷，常常会使“肉制品掺假”的风险疏于防控，从而引发一系列的社会问题。例如：2013年英国的“马肉风波”事件在世界范围内造成了极大的负面效应，不久，欧盟继马肉风波之后，又爆出鱼肉制品造假程度更甚的消息。因此，研发一种可以对肉制品中的动物源性成份进行全景扫描分析的技术方法对于“肉制品掺假”的风险防控至关重要。PCR-RFLP技术是一类被广泛用于物种鉴定的技术方法，该技术方法包括用通用引物扩增一段预选的DNA片段，根据DNA片段的序列选择合适的限制性内切酶，酶切DNA片段并产生特异性的酶切图谱，根据酶切图谱实现对物种的鉴定。通过构建标准物种酶切图谱库以及与测序技术的联合应用，PCR-RFLP可以很好的弥补real-time PCR技术的不足，实现对肉制品中的动物源性成份组成全景扫描[1，2]。目前，基于PCR-RFLP开发的鱼类物种鉴定技术已经相当成熟，已经有商品化的试剂盒出售。该试剂盒由Agilent Technologies公司研发，可以用于鉴定50种以上的鱼类物种[3]。基于PCR-RFLP技术对非鱼类物种成份的鉴定虽常有报道，但未形成商品化检测试剂盒。2005年Aida AA等人选用内切酶BsaJ I对长度为350bp的PCR产物进行酶切，实现了对清真食品中猪肉成份的鉴定[4]。2009年Abdel-Rahman SM.等人选用限制性内切酶Alu I对驴肉和马肉进行了有效区分[5]。同年，Chandrika M等人利用PCR-RFLP技术实现了对猪、牛、水牛、鹌鹑、鸡、山羊和兔子的鉴定。在该技术方法中，扩增的PCR产物片段长度为359bp，选用的内切酶包括Alu I，BsaJ I，Rsa I，Mse I和BstU I[6]。2012年，Nadia Haider等人以线粒体DNA为模板，利用条形码通用引物扩增长度为710bp的COI序列，选择限制性内切酶Hpa II切割COI片段，实现了对牛、鸡、火鸡、绵羊、猪、水牛、骆驼和驴的有效区分[7]。同年M.Eaqub等人选用限制性内切酶Alu I实现了对猪肉成份的鉴定[8]。2014年，Abbas D等人利用PCR-RFLP技术实现了对肠类食品中牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、驴肉和马肉的鉴定[9]。虽然近年来相关研究报道不断，但是这些方法主要存在以下几点技术局限性：1)所鉴别的物种种类范围狭窄；2)限制性内切酶片段多样性的分析手段自动化程度不高，样品之间易形成交叉污染；3)一些研究选择的内切酶种类过多，需进行多次酶切反应才能实现对动物源性成份的鉴别，操作繁琐。因此，有必要继续深入研究基于PCR-RFLP的物种鉴定技术，以实现对肉制品中禽类和哺乳动物类的物种成份进行全景扫描分析。DHPLC(变性高效液相色谱)是近年来发展起来的一项核酸分析技术。应用Transgenomic公司的DNA SepCartridge分离柱可以有效分离长度不同的DNA片段，并且该技术分辨率高，分析过程自动化，可以有效的防止样品间的交叉污染。本研究拟设计一对可以从样品中扩增出所有禽类和哺乳动物类物种成份COI片段的通用引物序列；通过对COI片段的核酸序列分析，筛选出可以有效区分各物种成份的限制性内切酶；利用筛选获得的内切酶对扩增获得的COI片段进行酶切；利用DHPLC技术绘制酶切图谱，构建阳性样本库，以实现对肉制品中禽类和哺乳动物类的物种成份进行全景扫描分析。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种分析肉制品的动物物种来源的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取肉制品样品的基因组DNA；2)以所述基因组DNA为模板，使用通用COI引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；3)将所述PCR产物进行酶切；和4)利用DHPLC对酶切产物进行分析，其中步骤2)中所述的通用COI引物对的序列为(方向5`-3`)：COI-F(正向引物):CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGACOI-R(反向引物):TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA其中：R表示A或G；Y表示C或T；D表示G或A或T；N表示A或T或G或C。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中步骤3)中进行酶切使用的内切酶为HindIII和/或HpaII。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中所述动物物种选自哺乳动物和禽类，优选选自反刍动物、犬科动物、兔科、猫科和家禽，和优选选自绵羊、山羊、马、驴、兔子、猫、鼠、牛、猪、狐狸、狗、貉、鹿、骆驼、鹌鹑、大雁、鸽子、鸡、鸭、火鸡和山鸡。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中在步骤3)中将获得的DHPLC的洗脱峰与同样条件下确定的已知动物物种的DHPLC的洗脱峰进行比对，如果两者的洗脱峰重合，则指示所述肉制品样品中存在来源于所述已知动物物种的成份。根据本专利技术的另一个优选实施方案，所述方法可用于分析所述肉制品样品中动物源性成份组成。在另一方面，本专利技术还提供一种用于分析肉制品的动物物种来源的试剂盒，其包括针对哺乳动物和禽类的通用COI引物对，其中所述通用COI引物对的序列为(方向5`-3`)：COI-F(正向引物):CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGACOI-R(反向引物):TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA其中：R表示A或G；Y表示C或T；D表示G或A或T；N表示A或T或G或C。根据本专利技术的一个优选实施方案，所述试剂盒还包含限制性内切酶Hind III和/或限制性内切酶Hpa III。根据本专利技术的另一个优选实施方案，所述试剂盒还包含标准DNA模板和/或PCR反应液，优选其中所述标准DNA模板是含有已知动物物种的COI序列的质粒或者基因组。在一个优选实施方案中，所述标准DNA模板是含有已知动物物种的COI序列(如cDNA序列或其互补序列)的质粒或者基因组。所述PCR反应液包括进行PCR反应所需的各种组分，如MgCl2、缓冲液、dNTP、Taq酶等，它们都是本领域技术人员公知的。根据本专利技术的另一个优选实施方案，所述试剂盒还包含阳性样本酶切图谱库，所述阳性样本酶切图谱库是指根据已知动物物种的COI序列的质粒或者基因组作为模板，使用权利要求6中所述的通用COI引物进行扩增，所获得的PCR产物使用限制性内切酶Hind III和/或限制性内切酶Hpa III进行酶切后的DHPLC洗脱峰图谱。本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析肉制品的动物物种来源的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取肉制品样品的基因组DNA；2)以所述基因组DNA为模板，使用通用COI引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；3)将所述PCR产物进行酶切；和4)利用DHPLC对酶切产物进行分析，其中步骤2)中所述的通用COI引物对的序列为(方向5`‑3`)：COI‑F(正向引物):CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGACOI‑R(反向引物):TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA其中：R表示A或G；Y表示C或T；D表示G或A或T；N表示A或T或G或C。
【技术特征摘要】
1.一种分析肉制品的动物物种来源的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取肉制品样品的基因组DNA；2)以所述基因组DNA为模板，使用通用COI引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；3)将所述PCR产物进行酶切；和4)利用DHPLC对酶切产物进行分析，其中步骤2)中所述的通用COI引物对的序列为(方向5`-3`)：COI-F(正向引物):CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGACOI-R(反向引物):TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA其中：R表示A或G；Y表示C或T；D表示G或A或T；N表示A或T或G或C。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中进行酶切使用的内切酶为HindIII和/或HpaII。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述动物物种选自哺乳动物和禽类，优选选自反刍动物、犬科动物、兔科、猫科和家禽，和优选选自绵羊、山羊、马、驴、兔子、猫、鼠、牛、猪、狐狸、狗、貉、鹿、骆驼、鹌鹑、大雁、鸽子、鸡、鸭、火鸡和山鸡。4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中将获得的DHPLC的洗脱峰与同样条件下确定的已知动物物种的DHPLC的洗脱峰进行比对，如果两者的洗脱峰重合，则指示所述肉制品样品中存在来源于所述已知动物物种的成份。5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：路勇，姜洁，宋丽萍，毛婷，张卫民，郭淼，胡智恺，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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