本发明专利技术公开了一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒。包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～9所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。利用上述引物组和探针及其试剂盒不仅能够非常特异性地鉴定区分出玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫，还能够进行定量检测，有效克服了这三种短体线虫在形态学上难以区分、检测工作量大、成本高的缺点，检测灵敏度可达到0.01条线虫，对实际检测工作有重要的推进意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病原检测
更具体地，涉及一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒。
技术介绍
短体线虫，也称为根腐线虫，是一种重要的迁移性内寄生线虫，该类线虫由70多个有效种组成。短体线虫在植物根内移动、穿刺和取食引起根组织形成坏死斑、空腔进而使根组织坏死。由于植株根部坏死，被短体线虫危害的植物会表现出缺水和营养不足的症状，短体线虫是造成经济损失最大的三种植物线虫之一。玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫是三种较常见的短体线虫，这三种短体线虫均可危害甘蔗，而且会复合侵染。另外这三种短体线虫不单分布广泛，而且寄主也较广，除侵染甘蔗外，还可以侵染其它重要的农作物，如玉米。只有正确鉴定和预测这三种线虫在田间的虫口数量，才能在实际工作中制定合理的防治措施以此避免更大的经济损失，因此，正确、精确地鉴定、统计出三种短体线虫的侵染情况和侵染量，对于实际工作具有重要的意义。然而，目前对短体线虫的鉴定主要是依据传统形态学的方法，而根据形态将短体线虫鉴定到种是一个复杂而费时的工作。特别是对于玉米短体线虫和拟玉米短体线虫，它们形态上极为相似，可用于区分的特征很少，而且在甘蔗地里会混合出现，这就需要鉴定人员有非常丰富的形态鉴定经验。此外，形态学的鉴定方法只能准确地鉴定短体线虫的成熟雌虫，但是在田间调查的时候，常常是大量的线虫处于幼虫阶段，要通过形态学方法准确地鉴定这些短体线虫幼虫，几乎是不可能的，因此，在实际的工作中，精确准确地区分玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫这三种线虫，以评价三种线虫的侵染情况，是很困难的。目前，国内外还未见有通过实时荧光定量PCR方法定性检测（鉴定）和定量甘蔗上这三种短体线虫的报道。由于玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫侵染甘蔗的根部，严重的影响甘蔗的产量与品质。因此，为避免更大的经济损失，亟需一种能够高效、准确鉴定这三种短体线虫的分子生物学方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫鉴定检测技术的不足，尤其是难以区分三者的缺陷，提供更加精准、高效、特异性好、灵敏性高的定量检测玉米短体线虫（Pratylenchus zeae）、拟玉米短体线虫（P. parazeae）和最短尾短体线虫（P. brachyurus）的实时荧光定量PCR方法和检测体系。本专利技术的目的是提供一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针。本专利技术另一目的是提供一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～9所示。优选地，所述探针qYP、探针qNP和探针qBP的5’ 端均标记有FAM荧光基团，3’ 端均标记有ECL荧光基团。所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。上述鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，也在本专利技术的保护范围之内。在应用时，当需要检测、鉴定某一样品中含有玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫中的哪一种及其含量时，同时使用所述的三套引物和探针分别以待测样品DNA为模板进行PCR鉴定，当引物组qYF2/qYR2和探针qYP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有玉米短体线虫；当引物组qNF/qNR和探针qNP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有拟玉米短体线虫；当引物组qBF2/qBR1和探针qBP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有最短尾短体线虫。所述引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR的退火温度为60℃，所述引物组qBF2/qBR1的退火温度为55℃。本专利技术还以上述引物组和探针建立了鉴定、定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的实时荧光定量PCR方法：以待测样品DNA为模板，分别利用引物组qYF2/qYR2和探针qYP、引物组qNF/qNR和探针qNP、引物组qBF2/qBR1和探针qBP进行实时荧光定量PCR，根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类并统计含量。所述实时荧光定量PCR的反应体系为：2 μL DNA，上、下游引物各0.4 μL （10 μM），探针0.4 μL （10 μM），10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH2O，共20 μL。其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。利用引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；利用所述引物组qBF2/qBR1进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环。另外，上述鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的试剂盒方面的应用，也在本专利技术的保护范围之内。一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述的引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。优选地，使用该试剂盒时，PCR反应体系按照如下比例进行：每20 μL体系中，分别加入2 μL DNA，上下游引物各0.4 μL（10 μM）、探针0.4 μL（10 μM）、10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH2O；其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。优选地，使用该试剂盒时，利用引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；利用所述引物组qBF2/qBR1进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环。另外，作为一种优选的可实施方式，该试剂盒的使用方法为：以待测样品DNA为模板，分别利用引物组qYF2/qYR2和探针qYP、引物组qNF/qNR和探针qNP、引物组qBF2/qBR1和探针qBP进行实时荧光定量PCR，根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类并统计含量。其中，对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方法提取得到的样品DNA均可用于检测。所述根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类的标准是：当引物组qYF2/qYR2和探针qYP的检测结果为特异性阳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1～9所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。
【技术特征摘要】
1.一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1～9所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。2. 根据权利要求1所述的鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述探针qYP、探针qNP和探针qBP的5’ 端均标记有FAM荧光基团，3’ 端均标记有ECL荧光基团。3.权利要求1或2所述鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，或在制备鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的试剂盒方面的应用。4.一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。6. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，使用该试剂盒时，PCR反应体系按照如下比例进行：每20 μL体系中，分别加入2 μL DNA，上、下游引物各0.4 μL、探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：卓侃，林柏荣，刘星彤，廖金铃，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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