一种检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用，属于食品检测技术领域。本发明专利技术的试剂盒采用SEQ ID NO.1-2所示的引物和SEQ ID NO.3所示的荧光探针对待测食品进行荧光定量PCR检测，根据Ct值判断食品中是否含有狍子源性成分。本发明专利技术试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，最低检测限为100fg，具有良好的检测食品中狍子源性成分的能力，能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用
本专利技术涉及食品检测
，具体地说涉及检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用。
技术介绍
动物源性食品在人们日常膳食中的比例逐步增大，各种冷鲜肉、精深加工的半成品肉、熟肉制品等消费比例逐年上升。但不同物种的肉品质和价格存在很大差异，给掺杂掺假创造了极大的利润空间为了谋取经济利益，有些不法企业和商贩在肉制品中使用低成本肉代替高价位肉的现象时有发生。这不仅严重侵害了消费者的健康和权益，还会涉及宗教信仰，导致民族问题，同时直接影响到国家的形象，社会的和谐发展以及政府的公信力。狍子肉作为一种肉食来源具有丰富的营养，和细嫩鲜美的口感，在中国特别是北方地区就有广大的消费人群。但市场上的狍子肉良莠不齐，真假难分，因此，研究出一种准确、快速、可靠地鉴别狍子源性成分的方法，就非常有必要。随着分子生物学方法在食品检验中的应用不断深入，食品中动物源性成分的鉴别技术也在不断发展，鉴别精度和检测灵敏度的不断提高，目前已初步形成了以基因检测为基础的方法体系。以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定的核心方法。物种特异性PCR根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现动物源性成分特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别可能的物种成分。多重PCR能够实现混合物中多个物种同时检测。近年来，实时荧光PCR技术是动物源性成分检测中研究最多的方法，与普通PCR相比，具有特异性强、灵敏度高、重现性好、有效降低污染等优点。哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，具有基因组小、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，然而，针对狍子源性成分检测的荧光PCR方法尚未见报导。因此，建立动物源性产品中狍子源性成分实时荧光PCR检测方法，对提高突发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用。本专利技术首先提供用于检测食品中狍子源性成分的引物对以及荧光探针，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示。本专利技术提供了上述引物对和荧光探针在检测食品中狍子源性成分中的应用。本专利技术提供了上述引物对和荧光探针在制备检测食品中狍子源性成分试剂盒中的应用。含有本专利技术引物对和荧光探针的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本专利技术的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本专利技术的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本专利技术所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为狍子基因组DNA。进一步地，本专利技术的试剂盒其20μL工作体系为：本专利技术试剂盒的工作程序为：预变性95℃10min；再经95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。本专利技术每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值<35.0时样品结果为阳性；Ct值≥35.0的样品结果为阴性。一种检测食品中狍子源性成分的方法，该方法以蛋白酶K消化法提取的食品中DNA，以其为模板，利用本专利技术提供的引物对和荧光探针进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。含有本专利技术引物对和探针的诊断试剂也属于本专利技术的保护范围。本专利技术试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为食品中狍子源性成分的检测提供了新的方法。本专利技术所述的荧光RCR技术可以准确快速的实现对食品中狍子源性成分的鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，不仅能为检测狍子源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。附图说明图1为本专利技术检测食品中狍子源性成分的荧光定量PCR方法的特异性验证结果，应用本专利技术的方法仅对狍子DNA有阳性扩增，其他25个物种的DNA检测均为阴性。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1引物的设计经大量比对GenBank中CYTB基因，选取CYTB基因高度保守且具有物种特异性基因序列为模板，设计狍子CYTB特异性引物对和Taqman探针，分别命名为狍子CYTB-F(P1)、狍子CYTB-R(P2)、狍子CYTB-Probe(Probe-P3)，用于Taqman实时荧光PCR扩增的引物和探针序列如下：狍子CYTB-F：5`-AGCAATACATTACACATCCGACACA-3`(SEQIDNO.1)狍子CYTB-R：5`-AAATATTGATGCTCCGTTTGCA-3`(SEQIDNO.2)狍子CYTB-P3：5`-FAM-AGCATTCTCCTCTGTTACTCACATCTGCCG-TAMRA-3`(SEQIDNO.3)实施例2荧光定量PCR检测方法的建立1、提取样品DNA(1)取狍肉样本0.2g，尽量剪碎。置于1.5ml离心管中加入1ml的细胞裂解缓冲液，20μl蛋白酶K(500μg/ml)，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12,000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。(2)加入等体积的苯酚:氯仿混合液(1:1)，振荡混匀，12,000rpm离心10min。(3)取上清液至另一管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12,000rpm离心10min。(4)取上清液至另一管，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀10min，12,000rpm离心10min。(5)弃上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min。(6)重复步骤5。(7)弃上清，将沉淀至室温干燥5min。(8)加50μlTE或ddH2O溶解沉淀，然后置于4℃或-20℃保存备用。2、采用实施例1的引物和探针，上述DNA为模板，以狍子CYTB基因通过基因工程方法制得的质粒标准品为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，建立荧光定量PCR检测体系。其20μL总工作体系为：其工作程序为：预变性95℃10min；再经95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值<35.0时样品结果为阳性；Ct值≥350本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测食品中狍子源性成分的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.检测食品中狍子源性成分的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。2.与权利要求1所述的引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在检测食品中狍子源性成分中的应用。4.权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在制备检测食品中狍子源性成分试剂盒中的应用。5.一种检测食品中狍子源性成分试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨玉，杨昕霆，赵琳娜，王丹，韩月贝，郭淼，毛婷，杜建平，陶庆会，宋丽萍，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心，
类型：发明
国别省市：北京;11