一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用，属于动物食品检测技术领域。本发明专利技术的基因微流体芯片固定有SEQ ID NO.1‑96所述核苷酸序列的32对引物和探针组合，对待测样品进行荧光定量PCR检测，根据Ct值判断待测样品中是否含有26种动物源性成分中任一种。本发明专利技术检测方法可实现3h内完成对26种动物源性成分的快速鉴别检测，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，最低检测限为1pg，能满足大批量、快速鉴别检测26种动物源性成分的要求，并能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度，具有较好的社会效益。

A microfluidic chip for simultaneous detection of 26 animal derived components and its application

The present invention provides a gene microfluidic chip for simultaneous detection of 26 kinds of animal derived ingredients and its application, belonging to the field of animal food detection technology. The gene of the invention of microfluidic chip is fixed with a SEQ ID NO.1 the 96 nucleotide sequence of 32 pairs of primers and probe combinations, measured by fluorescence quantitative PCR detection of treatment, according to the Ct value to judge whether the test sample contains 26 kinds of animal derived ingredients in any. The detecting method of the invention can realize the fast identification of 26 kinds of animal derived ingredients in the detection of 3H, has the advantages of accurate detection, high sensitivity, strong specificity, simple and rapid method, the minimum detection limit is 1Pg, can meet the need of large scale and rapid detection and identification of 26 kinds of animal derived ingredients, and can effectively resist the adulterated meat products, strengthen the protection of the interests of consumers, and has good social benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用
本专利技术涉及食品检测
，具体地说涉及检测食品中26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用。
技术介绍
食品中动物源性成分的鉴别是当今食品安全检测当中的重要一环，2013年牛肉中掺杂马肉的事件曾轰动整个欧洲，中国的市场上肉类产假现象也屡见不鲜，常有用鸭肉，鸡肉等价格便宜的肉类冒充牛羊肉贩卖的情况，甚至出现过在肉制品中掺杂被鼠药毒死的鼠肉而引起消费者中毒的事件。这些事件严重扰乱了食品市场的秩序，侵害了消费者的利益，严重者还可能会引起民族问题破坏社会和谐。随着市场的不断发展，肉类掺假的技术手段也在不断的提高，许多拼接肉是使用三种以上的肉类拼接压制而成的，而一些肉制品则通过掺入肉汤，油脂，添加剂等方式伪造牛羊肉的风味。另一方面，有些经销皮毛的不法商贩将毛皮动物的肉类伪造成牛羊肉贩卖，2013年山东省检出牛羊肉中被掺混了狐狸肉，一时间造成了轰动，也使得对毛皮动物肉类的检测成为了食品安全监控中的重要一项。这也标志着目前肉类掺假所涉及的物种范围更广，仅仅检测肉及肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭的成分已经不能满足市场风险检测的需要。目前，仅毛皮动物就包含了狐狸，水貂，鹿，兔子，骆驼等物种，若要以单个物种逐一进行基因检测的传统方法检测需要耗费大量的时间以及人力物力，容易造成误检，漏检等现象。目前的物种鉴别技术主要分为蛋白质鉴定和分子鉴定两种。蛋白质鉴定包括酶联免疫分析，SDS-PAGE电泳，等电点聚焦技术等，这些方法主要依靠检测不同物种间蛋白质的差异来进行物种鉴别。但由于蛋白质稳定性差，遇高温，酸、碱，及重金属等化学制剂易变性所以不适宜做熟肉制品的鉴别分析，在使用上有比较大的局限性。相对于蛋白质，DNA具有较强的稳定性，且中间差异大，所以在食品安全检测领域较常用的方法是基于DNA的分子鉴别技术，其中PCR技术以其快速灵敏特点得到了广泛的使用。在诸多的PCR技术中，常用于物种鉴定的有Taqman探针荧光PCR技术。Taqman探针荧光PCR技术是20世纪90年代诞生的的实时荧光PCR技术中的一种，是一种应用于核酸实时PCR检测的专利技术。该技术使用根据靶标核酸设计合成的DNA单链，并在单链的两端分别偶联上荧光报告基团和荧光淬灭基团，此结构称为TaqMan探针。相对于无差别嵌入到DNA双螺旋当中的SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高。而且DNA在当前食品中动物源性成分的检测标准中，有许多标准是基于Taqman探针法的。虽然Taqman探针法检测的准确性较高，但是，这种方法只能针对单一物种设计探针进行检测。食品中的肉类成分往往是复杂的，有可能存在的掺假成分也是未知的，若要检测一个肉类产品中是否存在猪牛、羊、鸡、鸭成分则需要经过5次试验才能够实现，通过这种方法对大量样本进行检测需要耗费检测人员大量的时间。而对于一些未知物种的掺假，如猫肉，鼠肉，狗肉等则可能造成漏检，从而造成一些不合格产品流向市场，对消费者造成危害。生物芯片的概念由Fodor等人在1991年提出(Fodor.sp,ReadJL.1991)，是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件，在生物芯片技术中，基因芯片是建立最早，研究最成熟的。基因芯片,又称DNA微阵列(DNAmicroarray)，是把大量已知序列探针集成在同一个基片(如玻片、膜)上，经过标记的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交,通过检测杂交信号,对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析。基因芯片的制备方法主要有两种：原位合成法和点样法.原位合成法是指将把腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基的核苷酸按不同次序化学偶联在相应的位点,原位合成序列不同的寡核苷酸探针。点样法一般首先按常规方法制备cDNA(或寡核苷酸)探针库,然后通过特殊的微喷头，分别把不同的探针溶液按照预先排定的顺序逐点点在片基表面，并通过物理和化学作用使探针固定于基片表面。这种芯片的固相载体一般为玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。目前，有应用醛基化玻璃片作为固相载体制作基因芯片16种动物源性成分的报道(宗卉，2011申请号：201110110348.2)这种方法需要先进行PCR反应，再与芯片上的探针进行杂交，最后对杂交后的芯片进行荧光扫描和数据处理，步骤多，方法繁琐。并且在反应时将所有探针置于同一液体环境下进行反应，探针容易受到环境干扰，从而降低灵敏性和特异性。将多个探针集成芯片后其特异性往往低于单一探针。另外，这种芯片易破损，不利于长期保存。因此，建立广泛物种的动物源性成分检测，对提高突发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片。本专利技术的另一目的在于提供利用该基因微流体芯片检测食品中动物源性成分的方法。本专利技术首先提供用于同时检测26种动物源性成分的引物探针组合，含有32对引物和探针组合，每个组合含有2条上、下游引物和1个Taqman探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-96所示，所述26种动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、猫、小鼠、狗、火鸡、鹿、鸽子、狐狸、水貂、骆驼、鸵鸟、兔子、鹅、狍子、马、鹌鹑、草鱼、三文鱼、鲈鱼、虹鳟和鲫鱼。本专利技术进一步提供了同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片，该芯片含有32对引物和探针组合，每个组合含有2条上、下游引物和1个Taqman探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-96所示，所述26种动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、猫、小鼠、狗、火鸡、鹿、鸽子、狐狸、水貂、骆驼、鸵鸟、兔子、鹅、狍子、马、鹌鹑、草鱼、三文鱼、鲈鱼、虹鳟和鲫鱼。进一步地，本专利技术的基因微流体芯片是384孔板结构的实时荧光定量PCR反应板，该反应板分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1μL的反应腔，反应腔中包埋核苷酸序列如SEQIDNO.1-96所示的引物和Taqman探针。本专利技术芯片中针对每一个探针包埋了三个平行重复孔，使食品样品在每一次试验中进行三重平行反应，能够提高结果的准确性。本专利技术提供了上述引物探针组合或基因微流体芯片在检测动物源性成分中的应用。本专利技术提供了上述引物探针组合或基因微流体芯片在保障食品安全中的应用。本专利技术提供了上述引物探针组合或基因微流体芯片在制备检测食品中动物源性成分试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种同时检测26种动物源性成分的试剂盒，含有上述引物探针组合或基因微流体芯片。本专利技术提供了一种同时检测食品中动物源性成分的方法，使用本专利技术的上述基因微流体芯片，将待测食品的DNA及PCR预混液加入基因微流体芯片的反应腔中，使用荧光定量PCR仪进行扩增，根据CT值判定结果。本专利技术的实施例中，使用AppliedBiosystems公司的qPCRTaqMan@MasterMixPCR预混液。在使用荧光定量PCR仪检测之前，还需要对上样后的基因微流体芯片离心进样和封口。所述离心进样是在离心机中，1200rpm离心1分钟，即可完成。通过此步骤，PCR反应液均本文档来自技高网...

【技术保护点】
同时检测26种动物源性成分的引物探针组合，其特征在于，含有32对引物和探针组合，每个组合含有2条上、下游引物和1个Taqman探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑96所示，所述26种动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、猫、小鼠、狗、火鸡、鹿、鸽子、狐狸、水貂、骆驼、鸵鸟、兔子、鹅、狍子、马、鹌鹑、草鱼、三文鱼、鲈鱼、虹鳟和鲫鱼。

【技术特征摘要】
2017.04.07 CN 20171022480581.同时检测26种动物源性成分的引物探针组合，其特征在于，含有32对引物和探针组合，每个组合含有2条上、下游引物和1个Taqman探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-96所示，所述26种动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、猫、小鼠、狗、火鸡、鹿、鸽子、狐狸、水貂、骆驼、鸵鸟、兔子、鹅、狍子、马、鹌鹑、草鱼、三文鱼、鲈鱼、虹鳟和鲫鱼。2.同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片，其特征在于，含有32对引物和探针组合，每个组合含有2条上、下游引物和1个Taqman探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-96所示，所述26种动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、猫、小鼠、狗、火鸡、鹿、鸽子、狐狸、水貂、骆驼、鸵鸟、兔子、鹅、狍子、马、鹌鹑、草鱼、三文鱼、鲈鱼、虹鳟和鲫鱼。3.如权利要求2所述的基因微流体芯片，其特征在于，基因微流体芯片是384孔板结构的实时荧光定量PCR反应板，该反应板分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵琳娜，杨昕霆，薛晨玉，王丹，黄华，郭淼，胡智恺，杨红莲，韩月贝，刘剑，李赫婧，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心，
类型：发明
国别省市：北京,11