用于检测HER2基因的FISH探针、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，利用两对引物、分别进行两步PCR获得探针，FISH探针包括有标记荧光染料的、针对HER2基因的第一组探针和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一样。本发明专利技术进行两步PCR获得探针，如果第一次PCR体系的扩增产生了错误片断，则第二次PCR体系的扩增能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此，增加了扩增特异性。同时通过两步PCR放大，提高了探针制备效率且降低了生产成本。

FISH probe for detecting HER2 gene, its preparation method and Application

The invention relates to a method for preparing a FISH probe for detection of HER2 gene, using two pairs of primers, respectively for the two step PCR probe, FISH probe labeled with fluorescent dye, including the first set of probes for HER2 gene and second probes for human chromosome 17 centromere region, fluorescent dye color mark the first group and the second group probe probe is not the same. The two step PCR probe, if the first PCR amplification system error is amplified fragments, in error of primers and amplified fragments of very low probability, the second PCR system therefore, increase the amplification specificity. At the same time, the preparation efficiency of the probe is improved and the production cost is reduced by two step PCR amplification.

【技术实现步骤摘要】
用于检测HER2基因的FISH探针、其制备方法及应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种用于检测HER2基因的FISH探针，同时本专利技术还涉及该FISH探针的制备方法及应用。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，仅次于宫颈癌。流行病学调查发现，5％～10％的乳腺癌是家族性的，有明显的家族遗传倾向。在40～60岁间、绝经期前后的妇女发病率较高。在我国，妇女乳腺癌发病率正逐年上升，并且显示出年轻化趋势。与30年前相比，我国乳腺癌死亡率上升了34.1％，其中城市上升了38.8％，它正以每年3％～4％的速度递增，死亡率已经排在女性癌症死亡率之首。乳腺癌病因尚未完全阐明，但许多研究资料表明，乳腺癌的发生除去出生地的因素外，还与内源性或外源性雌激素的长期刺激：雌激素的活性和表皮生长因子受体(HER2)的过表达对乳癌的发生有重要作用。人类HER-2/neu基因(Her-2基因)定位于染色体17q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成员之一。HER-2/neu蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，由于目前尚未发现能与HER-2/neu蛋白直接结合的配体.其主要通过与家族中其他成员包括EGFR(HERl/erbBI)，HER3/erbB3，HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结合。HER-2/neu蛋白常为异二聚体首选伴侣，且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活性。HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达情况及影响因素HER-2/neu蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性。肾细胞癌、子宫内膜癌等，并提示预后不良。荧光原位杂交的方法检测乳腺癌细胞中HER-2/neu基因(17q12)的扩增，作为判断预后以及乳腺癌药物治疗，尤其是抗HER-2单克隆抗体(赫赛汀)靶向治疗的一项辅助检测手段。目前检测HER2基因的方法包括:免疫组织化学(IHC)法检测HER2蛋白过表达、荧光原位杂交(FISH)法检测HER2基因拷贝数、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HER2ECD或肿瘤组织P185。但病理常规工作中最实用的方法是IHC和FISH。IHC较FISH节约成本、简单易行,但容易受到组织处理方法、固定时间等影响,其结果判断和解释存在较大的变异,而FISH具有高度的重复性和可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法。一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法包括以下步骤：a、提取探针合成模板：利用基因组DNA提取试剂盒提取人类基因组DNA，作为HER2基因以及17号染色体着丝粒区域检测探针合成的模板；b、第一步PCR反应：采用第一组PCR反应引物，以人体基因组DNA为模板，进行PCR体系的扩增，得到DNA产物；c、第二步PCR反应：采用第二组PCR反应引物，以与其对应的第一步PCR反应获得的DNA产物为模板进行PCR体系的扩增，得到第二步PCR反应产物；d、纯化：将第二步PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用PCR产物凝胶回收试剂盒进行切胶、回收、纯化，得到检测HER2基因的FISH探针；所述的第一组PCR反应引物包括HER2基因第一组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应引物；所述的第二组PCR反应引物包括HER2基因第二组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第二组PCR反应引物。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：利用两对引物、分别进行两步PCR获得探针，如果第一次PCR体系的扩增产生了错误片断，则第二次PCR体系的扩增能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此，增加了扩增特异性。同时通过两步PCR放大，提高了探针制备效率且降低了生产成本。进一步的，步骤b第一步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、2×EsTaqMasterMix。进一步的，步骤c第二步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、dNTP、荧光标记的dUTP、TaqDNA聚合酶、含Mg2+的10×Taq酶反应缓冲液。本专利技术直接通过荧光标记的dUTP在第二步PCR扩增反应过程中即可将探针产物进行荧光标记，操作方便、简单、高效、经济。进一步的，所述HER2基因第一组PCR反应引物包括以下15对：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12、SEQIDNO.13和SEQIDNO.14、SEQIDNO.15和SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和SEQIDNO.18、SEQIDNO.19和SEQIDNO.20、SEQIDNO.21和SEQIDNO.22、SEQIDNO.23和SEQIDNO.24、SEQIDNO.25和SEQIDNO.26、SEQIDNO.27和SEQIDNO.28、SEQIDNO.29和SEQIDNO.30；所述HER2基因第二组PCR反应引物包括以下15对：SEQIDNO.46和SEQIDNO.47、SEQIDNO.48和SEQIDNO.49、SEQIDNO.50和SEQIDNO.51、SEQIDNO.52和SEQIDNO.53、SEQIDNO.54和SEQIDNO.55、SEQIDNO.56和SEQIDNO.57、SEQIDNO.58和SEQIDNO.59、SEQIDNO.60和SEQIDNO.61、SEQIDNO.62和SEQIDNO.63、SEQIDNO.64和SEQIDNO.65、SEQIDNO.66和SEQIDNO.67、SEQIDNO.68和SEQIDNO.69、SEQIDNO.70和SEQIDNO.71、SEQIDNO.72和SEQIDNO.73、SEQIDNO.74和SEQIDNO.75。进一步的，所述17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应引物包括以下5对：SEQIDNO.91和SEQIDNO.92、SEQIDNO.93和SEQIDNO.94、SEQIDNO.95和SEQIDNO.96、SEQIDNO.97和SEQIDNO.98、SEQIDNO.99和SEQIDNO.100；所述17号染色体着丝粒区域第二组PCR反应引物包括以下5对：SEQIDNO.106和SEQIDNO.107、SEQIDNO.108和SEQIDNO.109、SEQIDNO.110和SEQIDNO.111、SEQIDNO.112和SEQIDNO.113、SEQIDNO.114和SEQIDNO.115。进一步的，所述HER2基因第一组PCR反应产物包括SEQIDNO.31-SEQIDNO.45，所述17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应产物包括SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、提取探针合成模板：利用基因组DNA提取试剂盒提取人类基因组DNA，作为HER2基因以及17号染色体着丝粒区域检测探针合成的模板；b、第一步PCR反应：采用第一组PCR反应引物，以人体基因组DNA为模板，进行PCR体系的扩增，得到DNA产物；c、第二步PCR反应：采用第二组PCR反应引物，以与其对应的第一步PCR反应获得的DNA产物为模板进行PCR体系的扩增，得到第二步PCR反应产物；d、纯化：将第二步PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用PCR产物凝胶回收试剂盒进行切胶、回收、纯化，得到检测HER2基因的FISH探针；所述的第一组PCR反应引物包括HER2基因第一组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应引物；所述的第二组PCR反应引物包括HER2基因第二组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第二组PCR反应引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、提取探针合成模板：利用基因组DNA提取试剂盒提取人类基因组DNA，作为HER2基因以及17号染色体着丝粒区域检测探针合成的模板；b、第一步PCR反应：采用第一组PCR反应引物，以人体基因组DNA为模板，进行PCR体系的扩增，得到DNA产物；c、第二步PCR反应：采用第二组PCR反应引物，以与其对应的第一步PCR反应获得的DNA产物为模板进行PCR体系的扩增，得到第二步PCR反应产物；d、纯化：将第二步PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用PCR产物凝胶回收试剂盒进行切胶、回收、纯化，得到检测HER2基因的FISH探针；所述的第一组PCR反应引物包括HER2基因第一组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应引物；所述的第二组PCR反应引物包括HER2基因第二组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第二组PCR反应引物。2.根据权利要求1所述的用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，其特征在于，步骤b第一步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、2×EsTaqMasterMix。3.根据权利要求2所述的用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，其特征在于，步骤c第二步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、dNTP、荧光标记的dUTP、TaqDNA聚合酶、含Mg2+的10×Taq酶反应缓冲液。4.根据权利要求1所述的用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法，其特征在于，所述HER2基因第一组PCR反应引物包括以下15对：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12、SEQIDNO.13和SEQIDNO.14、SEQIDNO.15和SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和SEQIDNO.18、SEQIDNO.19和SEQIDNO.20、SEQIDNO.21和SEQIDNO.22、SEQIDNO.23和SEQIDNO.24、SEQIDNO.25和SEQIDNO.26、SEQIDNO.27和SEQIDNO.28、SEQIDNO.29和SEQIDNO.30；所述HER2基因第二组PCR反应引物包括以下15对：SEQIDNO.46和SEQIDNO.47、SEQIDNO.48和SEQIDNO.49、SEQIDNO.50和SEQIDNO.51、SEQIDNO.52和SEQIDNO.53、SEQIDNO.54和SEQIDNO.55、SEQIDNO.56和SEQIDNO.57、SEQIDNO.58和SEQIDNO.59、SEQIDNO.60和SEQIDNO.61、SEQIDNO.62和SEQIDNO.63、SEQIDNO.64和SEQIDNO.65、SEQIDNO.66和SEQIDNO.67、SEQIDNO.68和SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：许宝芝，秦颖，白蛟腾，杨凯丽，
申请(专利权)人：德路通石家庄生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13