本发明专利技术涉及一种猪免疫力分子遗传标记及其应用，具体涉及一种猪miR-155前体侧翼序列SNP作为猪免疫性状的遗传标记，它是序列表SEQ?ID?No.1所示碱基序列。在序列表SEQ?ID?NO.1序列158bp处有一个碱基突变C158-T158，并导致HhaI-RFLP多态性。本发明专利技术用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子遗传标记制备
，具体涉及一种用miR-155前体侧翼序列预示和鉴定猪免疫力的分子标记的制备和应用。
技术介绍
在现代集约化饲养方式下，疾病特别是传染病成为制约养猪业健康、持续、稳步发展的主要因素。虽然通过采取加强饲养管理、改善环境卫生条件、应用药物和疫苗进行治疗和预防等措施使疾病得到了一定的控制，但从长远来看，采用育种措施从遗传角度提高猪群抗病力，才能使养猪业真正远离疾病的困扰。个体免疫力是衡量动物抗病能力的重要指标，阐明免疫性状的遗传机制，挖掘出具有重大育种价值的关键基因，在此基础上寻找可行 的分子标记，并在生产中应用，成为分子抗病育种研究的重点之畜禽免疫性状是受多基因控制的数量性状，目前对猪分子抗病育种的研究主要集中在以下三个方面(I)猪抗病性状的QTL研究。研究发现在SSC9，5，6，13存在猪伪狂犬病毒易感或抗性QTL ;在SSCl，8存在影响白细胞数量、血细胞容积、白细胞介素2 (interleukin2, IL2)和α干扰素(interferon α ,IFN α)分泌量等免疫指标的QTL ;在SSC7存在猪肉孢子虫的易感或抗性QTL ;在3305，7，8，12，13存在红细胞性状QTL。最近的研究发现发现猪1、2-4、6-8、12、15、16和18号染色体存在控制免疫性状的QTL。(2)猪抗病性状的候选基因研究。目前研究较清楚的是猪大肠杆菌Κ88和F18受体基因。国内学者也对这类基因进行了一定程度的研究。此外，选择与免疫应答相关的基因，如干扰素(iterfeixm，IFN)及其受体基因、猪白细胞抗原复合体(swine leukocyte antigen, SLA)及其抗原呈递基因、白细胞介素(interleukin, IL)、Toll 样受体(Tolllike receptors, TLRs)、自然抗性相关巨嗤蛋白 I (natural resistance-associated macrophage proteinl,NRAMPl)基因和Mxl 等基因作为免疫性状的候选基因，进行相应的研究。(3)病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究。Petry等测定了用猪繁殖与呼吸综合症病毒处理不同品系猪后各品系个体的肺组织和支气管淋巴结中免疫基因的表达谱，发现白细胞介素8 (interleukinS，IL8)可能是一个候选抗性基因。Zhao等利用基因芯片对正常猪与沙门氏菌感染猪的肺组织基因表达谱进行了研究，发现转谷氨酰胺酶基因家族基因(transglutaminase family genes, TFG), IFNs诱导基因(GBP1，GBP2, CIS, C1R，MHC2TA，PSMB8, TAPI, TAP2)等在感染前后表达差异显著。为了寻找新的免疫性状候选基因，国内外研究者利用mRNA差异显示技术和基因芯片技术从猪免疫细胞和器官中分离出一批新基因。目前，这些差异基因作为抗病育种候选基因的相关研究正在进行。虽然猪分子抗病育种研究已取得一定的成果，但目前鉴定的候选基因无法满足抗病育种的需要。由于构建用于抗病性状QTL定位的资源家系成本高、难度大，因此，利用候选基因法挖掘抗病性状的遗传标记仍将是猪分子抗病育种研究的重要内容。miR-155第一个被发现的参与免疫调控的miRNA。基因敲除研究发现，miR-155基因敲除小鼠与正常小鼠相比，抗细菌感染能力差、抗体滴度低、T细胞反应水平低。进一步研究发，敲除miR-155导致其它基因的活性发生改变，不能进行有效的免疫反应，容易发生自身免疫和感染。对miR-155的深入研究发现，该基因在免疫系统中发挥重要的调控作用。miR-155参与固有免疫(innate immune)细胞的发育调控。例如，miR-155通过作用于SHIP I (Srchomology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase I)导致粒细胞成熟障碍。在固有免疫应答中，miR-155 革巴向 FADD (Fas-associated death domain protein)，IKK ε (I κ Bkinase ε )和 Ripkl (receptor interacting serine-threonine kinase I)，进而精细调控免疫应答。此外，miR-155在获得性免疫(acquired immune)细胞的分化发育及功能调节中也发挥作用。miR-155 通过下调 SOCS I (suppressor of cytokine signaling I)来调控 T 细胞的增殖；通过下调 AICD (activation-induced cytidine deaminase)降低 IgG I 抗体水平，进而调控B细胞的型别转换。miR-155基因在哺乳动物免疫调控中发挥重要作用，但目前未见利用猪miR-155基因来寻找猪免疫性状相关分子标记的报道。鉴于此，我们选择该基因作为猪抗病育种的候选基因，克隆了该基因及其侧翼区域，利用该序列进行多态性分析和性状关联分析，以期获得猪免疫性状相关分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种寻找猪miR-155基因突变位点以及基因多态性的检测方法，也就是用miR-155基因预示和鉴定猪免疫力的分子标记方法。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术提供了包括猪miR-155基因及其侧翼区域的454bp的基因组核苷酸序列，通过不同个体的基因组核苷酸序列比对提供了位于猪454bp扩增片段内部的一处单核苷酸多态性(SNP)。具体为一种猪miR-155前体侧翼序列SNP作为猪免疫性状的遗传标记，它是序列表SEQ ID No. I所不碱基序列。在序列表SEQ ID NO. I序列158bp处有一个碱基突变C158-T158,并导致 HhaI-RFLP 多态性。制备该基因片段的步骤如下(I)选择民猪、长白猪和杜洛克猪各一头为试验材料，从猪血液中提取DNA ；(2)从miRBase下载猪miR-155基因的前体序列和成熟序列，利用ENSEMBL数据库(Sscrofa9)进行pre_miRNA染色体定位,将前体序列向5’和3’侧翼区分别步移600bp和300bp后下载序列。根据下载序列设计引物对如下F5/ -CTACCCACTTCGACTTATGAC-3'，R 5/ GGAACATCCCAGTGACCAG-3'；(3) PCR 扩增；(4) PCR产物纯化、克隆、测序。(5)序列比对分析。本专利技术提供了鉴定上述序列158bp处C/T变异的限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)基因型分型方法。其步骤包括(I)在猪基因组DNA中进行PCR扩增；(2) PCR扩增片段HhaI酶切分型及检测。本专利技术进一步提供了利用HhaI PCR-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的相关关系。根据本专利技术的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。附图说明图I :是本专利技术中用于检测分子标记的所克隆的猪miR-155及其侧翼区域序列，图中方框标记为碱基的突变位点，序列首尾的阴影区为引物对。 图2 :不同猪种经序列比对后发现的S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪免疫力分子遗传标记，它是序列表SEQ？ID？No.1所示碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：牛步月，杨秀芹，王希彪，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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