用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物制造技术

本发明专利技术公开了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，首次采用逆向血清-蛋白质组学技术在体研究肝癌MVI的相关抗原、抗体，确定了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，为临床术前早期诊断MVI提供一种有效的检测手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种血清标记物，尤其涉及一种用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物。
技术介绍
肝细胞肝癌微血管侵犯(microvascularinvasion,MVI)指显微镜下观察到内皮细胞衬覆的血管腔内可见癌细胞巢团。肝癌细胞侵犯微血管后所产生的隐匿性转移灶是引起肝癌术后复发的重要原因之一，文献证实MVI是肝癌切除术后预测复发、评估预后的一项独立指标。美国癌症联合委员会(AmericanJointCommitteeonCancer,AJCC)指南已将MVI作为肝癌TMN分期的重要因素之一。目前，针对MVI的诊断是依据术后或活检穿刺标本的病理学检查。在影像学水平，有学者采用GadoxetataDisodium作为造影剂行磁共振检查，发现其诊断的敏感性仅为38.3％。近年来，越来越多的学者从分子生物学水平研究MVI相关标记物，但是这些标记物的特异性及准确率均不理想，离临床诊断相距甚远。以往肝癌抗原的筛选方法主要是基于双向电泳-质谱分析技术，但这一技术存在一些不足：1.通过正常肝组织与肝癌组织做双向电泳，再经质谱分析鉴定抗原，其特异性不足；2.个体之间差异大，且肝癌具有多个阶段，故结果偏差大；3.对于某些重要蛋白不能有效识别，敏感性差。目前针对肝癌MVI的术前检测仍缺乏一种高效、准确的方式。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物。本专利技术用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，包含一种或多种下列蛋白：α烯醇化酶(Alpha-enolase)、多功能蛋白ADE2(MultifunctionalproteinADE2)、谷胱甘肽合成酶(Glutathionesynthetase)、微管蛋白α-1A链(Tublinalpha-1Achain)、酸醛缩酶A(Fructose-bisphosphatealdolaseA)、热休克蛋白70(Heatshockprotein70)、热休克蛋白90-α(Heatshockprotein90-alpha)、热休克蛋白75(Heatshockprotein75)、γ-烯醇酶(Gamma-enolase)、肌动蛋白、胞质1(Actin,cytoplasmic1)、酸醛缩酶A(Fructose-bisphosphatealdolaseA)、3-酮脂酰辅酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoAthiolase)、不均一核糖核蛋白(Heterogeneousnuclearribonucleoprotein)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceradehyde-3-phosphatedehydrogenase)、膜联蛋白A2(AnnexinA2)、L-乳酸脱氢酶A链(L-lactatedehydrogenaseAchain)、氨酰tRNA合成酶复合铰链多功能蛋白2(AminoacyltRNAsynthasecomplex-interactingmultifunctionalprotein2)、原肌球调节蛋白3(Tropomodulin-3)、SUMO-活化酶亚单位1(SUMO-activatingenzymesubnit1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂B6(SerpinB6)、DDB1-CUL4相关因子7(DDB1-andCUL4-associatedfactor7)。这些蛋白引起机体抗肿瘤免疫反应，血清中抗这些蛋白的抗体滴度增高。通过对抗体的检测，间接检测肝癌微血管侵犯。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次采用逆向血清-蛋白质组学技术在体研究肝癌MVI的相关抗原、抗体，确定了用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，为临床术前早期诊断MVI提供一种有效的检测手段。附图说明图1为逆向血清-蛋白质组学实验流程图；图2为肝癌血管侵犯的三种情况；图3为肝癌血清蛋白考马斯亮蓝染色及蛋白印迹曝光图，其中A、B分别为MVI(+)组、MVI(-)组血清蛋白考马斯亮蓝染色图，C、D分别为MVI(-)组、MVI(+)组血清蛋白印迹曝光图；图中，1为Alpha-enolase，2为Glutathionesynthetase(GST)，3为Heatshock70(HSP70)，4为Heatshock90(HSP90)，5为Actin，6为AnnexinA2；图4为MVI(+)与MVI(-)患者血清HSP70和Alpha-enolase的抗体含量。具体实施方式下面结合附图详细说明本专利技术血清标记物的筛选及逆向验证过程。本专利技术实验收集整理160份肝癌组织标本库，包括患者术前外周血、术后肝癌组织、癌旁正常组织、及相关临床病例资料。参照图1所示流程进行逆向血清-蛋白质组学实验研究。一.需要收集的样本，每例所含：1)肿瘤组织石蜡块×1；2)肿瘤组织新鲜标本×1存于-80℃冰箱；3)肿瘤旁正常肝组织石蜡块×1；4)肿瘤旁正常肝组织新鲜标本×1存于-80℃冰箱；5)两次离心后血浆上清液×1存于-80℃冰箱；6)离心后沉淀物(正常组织)×1存于-80℃冰箱。1.血标本采集步骤：1)采集6ml外周血置入EDTA管(2管，每管3ml)；2)810g离心10min；3)吸取离心后血浆到1.5ml离心管，16000g离心10min；4)吸取上清液到新的离心管，冻存于-80℃冰箱；5)沉淀物冻存于-80℃冰箱；2.肿瘤标本采集步骤：1)切取小块肿瘤组织置于5ml离心管中，加入福尔马林液备做石蜡块；2)另切取小块肿瘤组织置于冻存管中，液氮处理后存于-80℃冰箱；3)切取小块距肿瘤1cm正常肝组织置于5ml离心管中，加入福尔马林液备做石蜡块；4)另切取小块距肿瘤1cm正常肝组织置于冻存管中，液氮处理后存于-80℃冰箱。3.病理筛选MVI(+)和MVI(-)患者：所有病理切片均由浙江大学医学院附属第二医院资深病理科医生确认，如有异议，则邀请另一同级别的医生鉴定、讨论。判断肝癌MVI参照2002年JournalofGastrointestinalSurgery中EsnaolaNF等报道的标准，肝癌侵犯血管的三种情况如图2所示，其中图A箭头所指为未被侵犯的微血管，内皮完整；图B箭头所指为微血管内漂浮的癌栓，管壁已被肿瘤破坏，周围包绕有不完整的内皮细胞；图C箭头所指为门静脉分支内肉眼癌栓(HE染色100X)。本实验将临床资料相似的患者标本分为MVI(+)和MVI(-)两组(即微血管侵犯和无血管侵犯两组)，第一阶段选取10名患者，5名MVI(-)和5名MVI(+)患者，与培养的7703肝癌<本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，其特征在于，所述的血清标记物包含一种或多种下列蛋白：α烯醇化酶、多功能蛋白ADE2、谷胱甘肽合成酶、微管蛋白α‑1A链、酸醛缩酶A、热休克蛋白70、热休克蛋白90‑α、热休克蛋白75、γ‑烯醇酶、肌动蛋白、胞质1、酸醛缩酶A、3‑酮脂酰辅酶A硫解酶、不均一核糖核蛋白、3‑磷酸甘油醛脱氢酶、膜联蛋白A2、L‑乳酸脱氢酶A链、氨酰tRNA合成酶复合铰链多功能蛋白2、原肌球调节蛋白3、SUMO‑活化酶亚单位1、丝氨酸蛋白酶抑制剂B6、DDB1‑CUL4相关因子7。

【技术特征摘要】
1.用于术前检测肝癌微血管侵犯的血清标记物，其特征在于，所述的血清标记物包含
一种或多种下列蛋白：
α烯醇化酶、多功能蛋白ADE2、谷胱甘肽合成酶、微管蛋白α-1A链、酸醛缩酶A、热休克蛋
白70、热休克蛋白90-α、热休克蛋白75、γ-烯醇酶、肌动蛋白、胞质1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李江涛，金赟，于源泉，周佳乐，钱程明，杨俊杰，张小小，
申请(专利权)人：李江涛，
类型：发明
国别省市：浙江;33