核酸序列测序接头及其构建测序文库的方法技术

本发明专利技术提供一种核酸序列测序接头及其构建核酸测序文库的方法。本发明专利技术的测序接头包括长Y引物和短Y接头，在测序的插入片段二端都连接有所述短Y接头和长Y引物；所述短Y接头具有部分互补的上游引物F和下游引物R，所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7；和所述短接头是用来对同一个文库内部的不同分子进行标签识别，而所述长Y引物是用来对不同文库进行标签识别。本发明专利技术的核酸测序接头和建库方法能够更加准确的识别突变位点信息，大大提高检测体系的阳性预测能力，克服液体活检应用中存在的问题。

Sequencing Joints of Nucleic Acid Sequences and the Method of Constructing Sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
核酸序列测序接头及其构建测序文库的方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及核酸序列测序接头及其构建测序文库的方法。
技术介绍
液体活检弥补组织检测的不足，同一癌种的不同患者，同一个肿瘤患者的不同治疗阶段、同一肿瘤组织的不同区域，肿瘤的生物学特征均存在一定的差异。液体活检既可以克服组织检测的异质性，又具有简便、安全、无创、实时等特点，尤其是对于无法进行手术或穿刺，又或者肿瘤位置导致取样困难的患者而言，液体活检是一项可以弥补组织检测局限性的方法，近年来在肿瘤靶向治疗、耐药监测的实时评估等方面发挥着重要的作用。目前液体活检的靶标包括：游离的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)和外泌体(携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等)。ctDNA是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA(cfDNA)，在血液中的半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化。肿瘤患者体内的肿瘤细胞数量远远低于正常细胞，cfDNA在血浆中的含量很低，而ctDNA仅占cfDNA的0.1％～5％，且不同癌种，不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大，因此相比于组织检测，ctDNA的检测需要更高的灵敏度和特异性。目前用于ctDNA液体活检的技术主要有ARMS-PCR、数字PCR(ddPCR)和第二代测序(NGS)。NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是应用最广泛的的基因检测技术。但由于NGS的实验流程技术较为复杂，在文库构建、目标区域捕获及测序过程中不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误我们把它们叫做背景噪音，而ctDNA检测往往突变频率较低，受到背景噪音干扰较大，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成假阴性或假阳性结果，这就限制了ctDNA检测的灵敏度和特异性。分子条形码又称分子标签(UniqueMolecularindentifier，UMI)，它的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据不同的标签序列我们就可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
技术实现思路
在一种实施方式中，本专利技术提供提供一种核酸序列测序接头，所述测序接头包括长Y引物和短Y接头，在测序的插入片段二端都连接有所述短Y接头和长Y引物；所述短Y接头具有部分互补的上游引物F和下游引物R，上游引物F和下游引物R分别含有标签序列UMI和标签序列UMI’，标签序列UMI和标签序列UMI’互补，且标签序列位于上游引物F和下游引物R形成的互补区域内；所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7，所述上游引物P5含有标签序列indexD；所述下游引物P7含有标签序列indexN；和所述短接头是用来对同一个文库内部的不同分子进行标签识别，而所述长Y引物是用来对不同文库进行标签识别。在一种实施方式中，所述短Y接头的上游引物F和下游引物R通过退火形成部分双链结构。在一种实施方式中，所述上游引物F自5’端依次为通用序列、标签序列和游离碱基T；所述下游引物R自5’端依次为标签序列和通用序列，下游引物R的5’末端进行磷酸化修饰；所述标签序列由A、G、C、T任意排列组成。在一种实施方式中，所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7，所述上游引物P5自5’端依次为通用序列、标签序列indexD和第一连接序列；所述下游引物P7自5’端依次为通用序列、标签序列indexN和第二连接序列；所述上游引物P5的第一连接序列与所述上游引物F的通用序列的一部分或全部通过互补结合，所述下游引物P7的第二连接序列和所述下游引物R的通用序列的一部分或全部通过互补结合。在一种实施方式中，所述标签序列UMI和标签序列UMI’中碱基数量为4-6个，和标签序列indexD和标签序列indexN中碱基的数量为6-8个。在一种实施方式中，当所述标签序列为4个碱基自由组合时，所述短Y接头的上游引物F为序列SEQNo.1:CCTACACGACGCTCTTCCGATCNNNNT，所述短Y接头的下游引物R为序列SEQNo.2:NNNNGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA；所述上游引物F中的标签序列位于自5’端第23至第26位，所述下游引物R中的标签序列位于自5’端第1至第4位；所述N可以为A、G、C、T四种碱基的任意一种，但是不出现连续四个相同碱基。在一种实施方式中，当所述indexD标签序列和标签序列indexN由8个碱基组成时，所述长Y引物P5序列为：；长Y引物P5序列中加粗的碱基为indexD标签序列所在的位置；所述长Y引物P7序列为：长Y引物P7序列中加粗的碱基为标签序列indexN所在的位置。在一种实施方式中，本专利技术提供一种利用上述测序接头构建核酸测序文库的方法，所述方法包括：步骤1，利用酶反应将cfDNA样本进行末端修复及加A；步骤2，将上述经过末端修复、加A的cfDNA和短Y接头进行连接反应；步骤3，将连接产物利用长Y引物进行PCR扩增；和步骤4，纯化PCR扩增产物得到游离DNA样本文库。本专利技术在以上技术方案的基础上的优势表现为：(1)使用本专利技术的核酸测序接头，能够有效的区分和原始分子一样的其他ctDNA分子，一般ctDNA的提取量都比较低，通常只有十几纳克，本专利技术的核酸测序接头标签的优势在于有效区分不同的ctDNA分子，降低背景噪音，提高检测的灵敏度。(2)本专利技术的核酸测序接头由短Y接头和长Y引物两部分构成，短Y接头用来标记特定文库内部的不同分子，所以当进行多个文库构建时，连接过程可以采用同一种短Y接头混合物，在后期PCR扩增的过程中只要加入不同的长Y扩增引物就可以进行区分，这样设计的优势在于极大的节省了引物反复合成的成本，而且操作方便。本专利技术的核酸测序接头和建库方法能够更加准确的识别突变位点信息，大大提高检测体系的阳性预测能力，克服液体活检应用中存在的问题。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为本专利技术的核酸序列测序接头的结构示意图；图2为ctDNA标准品的PPV结果对比分析图。具体实施方式为了使本领域
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例的定量实验中，均是设置三次重复实验，结果取平均值。实施例一本专利技术的核酸序列测序接头1.本专利技术的核酸序列测序接头如图1所示，在测序的插入片段一端连接短Y接头，短Y接头包括上游引物F和下游引物R，上游引物F和下游引物R具有部分互补的序列，它们分别含有互补的标签序列UMI和UMI’，标签序列UMI和标签序列UMI’位于上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸序列测序接头，其特征在于，所述测序接头包括长Y引物和短Y接头，在测序的插入片段二端都连接有所述短Y接头和长Y引物；所述短Y接头具有部分互补的上游引物F和下游引物R，上游引物F和下游引物R分别含有标签序列UMI和标签序列UMI’，标签序列UMI和标签序列UMI’互补，且标签序列位于上游引物F和下游引物R形成的互补区域内；所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7，所述上游引物P5含有标签序列index D；所述下游引物P7含有标签序列index N；和所述短接头是用来对同一个文库内部的不同分子进行标签识别，而所述长Y引物是用来对不同文库进行标签识别。

【技术特征摘要】
1.核酸序列测序接头，其特征在于，所述测序接头包括长Y引物和短Y接头，在测序的插入片段二端都连接有所述短Y接头和长Y引物；所述短Y接头具有部分互补的上游引物F和下游引物R，上游引物F和下游引物R分别含有标签序列UMI和标签序列UMI’，标签序列UMI和标签序列UMI’互补，且标签序列位于上游引物F和下游引物R形成的互补区域内；所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7，所述上游引物P5含有标签序列indexD；所述下游引物P7含有标签序列indexN；和所述短接头是用来对同一个文库内部的不同分子进行标签识别，而所述长Y引物是用来对不同文库进行标签识别。2.根据权利要求1所述的测序接头，其特征在于，所述短Y接头的上游引物F和下游引物R通过退火形成部分双链结构。3.根据权利要求1所述的测序接头，其特征在于，所述上游引物F自5’端依次为通用序列、标签序列和游离碱基T；所述下游引物R自5’端依次为标签序列和通用序列，下游引物R的5’末端进行磷酸化修饰；所述标签序列由A、G、C、T任意排列组成。4.根据权利要求3所述的测序接头，其特征在于，所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7，所述上游引物P5自5’端依次为通用序列、标签序列indexD和第一连接序列；所述下游引物P7自5’端依次为通用序列、标签序列indexN和第二连接序列；所述上游引物P5的第一连接序列与所述上游引物F的通用序列的一部分或全部通过互补结合，所述下游引物P7的第二连接序列和所述下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金银，李宏志，刘琦，许立志，
申请(专利权)人：北京京诺玛特科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11