基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法技术

本发明专利技术公开了基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。本发明专利技术通过设计捕获探针引物，然后与基因组DNA进行杂交反应，得到目的DNA片段后进行延伸、连接反应，后对目的DNA片段进行PCR扩增，纯化后即可进行文库测序。本发明专利技术的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。

Preparation of nucleic acid capture library based on hybridization and elongation ligation reaction

【技术实现步骤摘要】
基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法
本专利技术涉及一种基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测

技术介绍
高通量测序技术发展后测序成本降低，但测序之后的庞大的数据量分析工作难度加大。测序深度更高后导致测序的数据量越来越大，分析工作也是越来越困难。近年来测序技术的发展逐渐形成了两个方向：大而全的全基因组测序(WholeGenomeSequencing)和小而精的靶向捕获测序(TargetCaptureSequencing)。与全基因组测序相比，捕获测序可以针对感兴趣的区域进行分离与富集，可以大大降低后续的数据分析工作。在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向捕获所能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现的。由于捕获测序在测序前就对基因的目标区域进行了分离与富集，目标区域的大幅减少可实现5000×甚至更高的测序深度。测序深度的提高意味着更高的灵敏度(能够检测低频率的变异)，其检测极限低至0.1％。靶向捕获方法主要包括杂交捕获、分子倒置探针以及多重PCR。杂交捕获根据核酸分子碱基互补杂交原理，设计分子探针。探针可以和目标区域通过碱基互补配对结合，从而将目标区段捕获。非捕获区域会被洗脱丢弃，之后通过变性(一般是调节PH值到碱性)将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序。一般来说，杂交捕获根据探针状态的不同分为固态杂交和液态杂交。优点是捕获的区段大，均一性好，缺点是特异性差。因为样本是随机打断，捕获时候可能与部分目的区段杂交，导致含有部分目的区段的片段被捕获。分子倒置探针(MIP)技术优势是特异性好而且捕获完成后的片段直接完成了建库(杂交捕获后还需要构建测序文库，主要是添加Index和测序接头)。其原理是设计一个口袋状探针，H1和H2能和目标区段退火，然后利用DNA聚合酶将探针缺口补齐，同时添加DNA连接酶，将缺口处磷酸二酯键连接，即可构成一个完整的环状探针。然后通过外切酶将游离的探针消化，完整的探针包括目标区段的序列，利用通用序列作为后续文库构建的引物(可添加index和测序引物)，扩增产物可以直接作为二代测序文库。优点是特异性高，但是缺点是捕获效率不高。多重PCR富集是目前应用比较广泛的，适合大规模样本的捕获方法，主要以Life公司和Illumina公司的两种方法为主：IonAmpliseq最关键之处在于引物设计，该公司设计的引物可以满足1000-2000重单管反应。优点：方法简单，起始量低至10ng，在PCR产物以及石蜡样本中有明显优势。难点：引物池是需要丰富的引物设计经验，目前只有thermo做的好，并且将经验做成了软件，登陆www.ampliseq.com提交序列即可。Illumina公司的方法：针对目标区段设计两段探针，探针和DNA双链中的一条链杂交，通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，将探针中间的缺口补齐。上下游探针携带有通用序列，之后利用携带通用序列的建库引物(index和测序引物等)进行扩增以后即完成建库。优点是保证多个扩增子扩增效率的一致性，缺点是连接反应操作繁琐，并且对起始模板浓度要求比较高。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，开发一种比较灵活的，操作简单，耗时较短的靶向区域捕获建库方法，尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。本专利技术的第一个目的是提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，包括如下步骤：(1)针对1～20位需要捕获的位点进行捕获探针引物设计，使目的区域延伸长度在150bp-200bp之间；这个延伸长度可以满足双端测序时目的序列部分覆盖两次，结果更加准确；(2)将基因组DNA加热变性后，与步骤(1)设计的捕获探针引物、杂交液进行杂交，捕获探针引物与基因组DNA上的目的区域进行结合；(3)加入延伸反应试剂，对步骤(2)捕获成功的DNA片段进行碱基延伸反应；(4)添加连接反应试剂进行连接反应，连接步骤(3)延伸反应后DNA片段的缺口；(5)添加只对单链DNA片段作用的核酸酶，消化多余的脱氧核糖核苷三磷酸和杂交引物；(6)采用PCR反应扩增捕获成功的DNA片段，并加上测序所需的接头序列；(7)纯化后进行测序。进一步地，所述杂交液包括50-100mMNaCl、10-20mMTris-HCl、10-20mMMgCl2和1-2mMDTT，pH7.0-8.0。进一步地，所述延伸反应试剂包括10XKlenowfragmentbuffer、Klenowfragment、dNTP(10mM)和H2O。进一步地，所述的连接反应试剂包括TaqDNALigase、10XTaqDNALigaseBuffer(dATP)、延伸反应产物和H2O。进一步地，在步骤(5)中，所述核酸酶为EcoRI。进一步地，所述的接头序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQIDNO.1)和5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3’(SEQIDNO.2)。进一步地，在步骤(1)中，所述的需捕获的位点为rs11235604、rs750188782、rs2228479、rs2143340、rs401681、rs26722、rs1051168、rs5219、rs1048990、rs1041981、rs429358、rs2738058、rs1799752、rs2395029、rs6706649、rs9904341、rs2736098、rs2153271、rs201038679或rs1001179中的一种或多种。进一步地，在步骤(7)中采用AmpureXP磁珠对PCR产物进行纯化。进一步地，在步骤(7)中，所述的测序采用的是二代测序仪进行测序。本专利技术的有益效果是：本专利技术的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。附图说明图1为本专利技术靶向捕获方法原理示意图；图2为rs6706649位点测序数据进行结果分析图；图3为rs401681位点测序数据进行结果分析图；图4为rs26722位点测序数据进行结果分析图；图5为rs2736098位点测序数据进行结果分析图；图6为rs2143340位点测序数据进行结果分析图；图7为rs1041981位点测序数据进行结果分析图；图8为rs2395029位点测序数据进行结果分析图；图9为rs2738058位点测序数据进行结果分析图；图10为rs2153271位点测序数据进行结果分析图；图11为rs11235604位点测序数据进行结果分析图；图12为rs5219位点测序数据进行结果分析图；图13为rs1001179位点测序数据进行结果分析图；图14为rs750188782位点测序数据进行结果分析图；图15为rs201038679位点测序数据进行结果分析图；图16为rs1048990位点测序数据进行结果分析图；图17为rs1051168位点测序数据进行结果分析图；图18为rs2228479位点测序数据进行结果分析图；图19为rs1799752位点测序数据进行结果分析图；图20为rs本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对1～20位需要捕获的位点进行捕获探针引物设计，使目的区域延伸长度在150bp‑200bp之间；(2)将基因组DNA加热变性后，与步骤(1)设计的捕获探针引物、杂交液进行杂交，捕获探针引物与基因组DNA上的目的区域进行结合；(3)加入延伸反应试剂，对步骤(2)捕获成功的DNA片段进行碱基延伸反应；(4)添加连接反应试剂进行连接反应，连接步骤(3)延伸反应后DNA片段的缺口；(5)添加只对单链DNA片段作用的核酸酶，消化多余的脱氧核糖核苷三磷酸和杂交引物；(6)采用PCR反应扩增捕获成功的DNA片段，并加上测序所需的接头序列；(7)纯化后进行测序。

【技术特征摘要】
1.一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对1～20位需要捕获的位点进行捕获探针引物设计，使目的区域延伸长度在150bp-200bp之间；(2)将基因组DNA加热变性后，与步骤(1)设计的捕获探针引物、杂交液进行杂交，捕获探针引物与基因组DNA上的目的区域进行结合；(3)加入延伸反应试剂，对步骤(2)捕获成功的DNA片段进行碱基延伸反应；(4)添加连接反应试剂进行连接反应，连接步骤(3)延伸反应后DNA片段的缺口；(5)添加只对单链DNA片段作用的核酸酶，消化多余的脱氧核糖核苷三磷酸和杂交引物；(6)采用PCR反应扩增捕获成功的DNA片段，并加上测序所需的接头序列；(7)纯化后进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交液包括50-100mMNaCl、10-20mMTris-HCl、10-20mMMgCl2和1-2mMDTT，pH7.0-8.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述延伸反应试剂包括10XKlenowfragmentbuffer、Klenowfragment、dNTP和H2O。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的连接反应试剂包括TaqDNALi...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓玲，刘冬梅，
申请(专利权)人：上海三誉华夏基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31