引物组合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了引物组合物及其用途，其中该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核酸序列构成，所述第一反向引物由目标区域特异性反向引物和第二核酸序列构成；第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，其中，所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头。利用该引物组合物对待测样品的包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，一步即能够实现目标区域核酸的富集，并且，PCR扩增产物直接构成测序文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及引物组合物及其用途，更具体的，本专利技术涉及引物组合物、构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法、确定待测样品目标区域核酸序列的方法、同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法、确定待测样品目标区域核酸序列的系统以及同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的系统。
技术介绍
目前使用的目标区域富集测序的技术主要采用两种策略：探针杂交捕获和PCR扩增富集。其中，探针杂交捕获，整个流程大概需要4到7天，通常一个目标区域的成本从几百到几千元不等，而且探针设计合成的周期通常为6到8周甚至更长时间。基于PCR原理的目标区域富集技术通常只需要进行PCR和加接头操作就可以上机测序，整个流程一般只需要1-2天，前期引物设计合成周期一般为2-4周，而且引物设计相对灵活，几十到几千对都可以，一个样本的成本一般可以低至几十元到几百元，相对于探针杂交捕获具有一定的优势。然而，目前的PCR扩增富集目标区域的方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前的PCR扩增富集目标区域的方法在扩增结束之后都要在产物上再加上一个接头才能进行后续的测序，需两步PCR反应，且中间还需要加入纯化步骤。因而，步骤较多，过程仍较复杂，不利于较大样本量以及较多目标区域的PCR扩增富集。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于，通过不断优化引物设计、PCR反应体系和PCR热循环程序等，提出一种与现有方法相比，步骤更少，操作更简单，需时更少，样本量和引物数量选择方面更加灵活的PCR扩增富集目标区域的方法，并且结合高通量芯片实施该方法，即可容易地实现同时对多样本多区域进行目标区域富集。因而，根据本专利技术的一个方面，首先本专利技术提供了一种引物组合物。根据本专利技术的实施例，该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核酸序列构成，所述第一核酸序列位于所述目标区域特异性正向引物的5’端，所述第一反向引物由目标区域特异性反向引物和第二核酸序列构成，所述第二核酸序列位于所述目标区域特异性反向引物的5’端，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列均为公共序列，且所述第一核酸序列和所述第二核酸序列不同；第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，其中，所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第一测序接头位于所述第一核酸序列的5’端，所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头，所述第二测序接头位于所述第二核酸序列的5’端。专利技术人惊奇地发现，利用本专利技术的引物组合物对待测样品的包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，一步即能够实现目标区域核酸的富集，并且，PCR扩增产物即富集的目标区域核酸直接构成测序文库，进而无需额外的测序接头连接、连接产物纯化的步骤，能够直接进行测序，成本低、效率高，并且测序结果准确、可靠，可重复性好。根据本专利技术的又一方面，本专利技术还提供了一种构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：利用前面所述的引物组合物，对待测样品包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样品目标区域核酸测序文库。根据本专利技术的实施例，利用本专利技术的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，一步即能够实现待测样品目标区域核酸的富集及目标区域核酸测序文库的构建，并且，操作简单，需时少，样本量和引物数量选择方面更加灵活，结合高通量芯片实施该方法时，能够容易地实现同时对多样本多区域进行目标区域富集。此外，根据本专利技术的实施例，利用该方法构建待测样品目标区域核酸测序文库，操作简单、需时少、成本低、效率高，并且获得的目标区域核酸测序文库，能够直接进行测序，测序结果准确、可靠，可重复性好。此外，本专利技术的方法适于微量DNA样本尤其是纳升级样本的目标区域核酸富集和文库构建。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种确定待测样品目标区域核酸序列的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库；对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。专利技术人发现，利用本专利技术的方法能够方便地确定待测样品目标区域核酸序列，并且操作简单，需时少，样本量和引物数量选择方面灵活，测序结果准确、可靠，可重复性好。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还提供了一种同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述第二正向引物的第一核酸序列和第一测序接头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序接头之间，进一步包含标签序列，且所述多个待测样品的标签序列相互不同，所述多个为至少2个；将所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库；对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库的序列和所述标签序列；以及基于所述标签序列对所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测样品的每一个的目标区域核酸序列。专利技术人发现，利用本专利技术的方法能够同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列，并且操作简单，需时少，样本量和引物数量选择方面灵活，并且测序结果准确、可靠，可重复性好。根据本专利技术的又一方面，本专利技术还提供了一种确定待测样品目标区域核酸序列的系统。根据本专利技术的实施例，该系统包括：文库构建装置，所述文库构建装置中设置有前面所述的引物组合物，用于根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库；第一测序装置，所述第一测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及第一核酸序列确定装置，所述第一核酸序列确定装置与所述第一测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。根据本专利技术的实施例，利用本专利技术的系统，能够方便、快捷地确定待测样品目标区域核酸序列，并且样本量和引物数量选择方面灵活，测序结果准确、可靠，可重复性好。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种同时确定多个待测样品的目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物组合物，其特征在于，包含：第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核酸序列构成，所述第一核酸序列位于所述目标区域特异性正向引物的5’端，所述第一反向引物由目标区域特异性反向引物和第二核酸序列构成，所述第二核酸序列位于所述目标区域特异性反向引物的5’端，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列均为公共序列，且所述第一核酸序列和所述第二核酸序列不同；第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，其中，所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第一测序接头位于所述第一核酸序列的5’端，所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头，所述第二测序接头位于所述第二核酸序列的5’端。

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其特征在于，包含：
第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，
其中，
所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核酸序列构成，所述第一核酸序列
位于所述目标区域特异性正向引物的5’端，
所述第一反向引物由目标区域特异性反向引物和第二核酸序列构成，所述第二核酸序列
位于所述目标区域特异性反向引物的5’端，
所述第一核酸序列和所述第二核酸序列均为公共序列，且所述第一核酸序列和所述第二
核酸序列不同；
第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，
其中，
所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第一测序接头位于所述第一
核酸序列的5’端，
所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头，所述第二测序接头位于所述第二
核酸序列的5’端。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述第二正向引物的第一核酸序
列和第一测序接头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序接头之间，进
一步包含标签序列，
任选地，所述标签序列的长度为6-11nt，
任选地，所述目标区域特异性正向引物和所述目标区域特异性反向引物的长度均为
18-25nt，
任选地，所述第一核酸序列为：5’-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3’(SEQIDNO:1)，
所述第二核酸序列为：5’-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3’(SEQIDNO:2)，
任选地，所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Illumina测序平台的P5测序接
头和P7测序接头，
优选地，在所述标签序列和所述第一测序接头P5之间进一步包含长度为4nt的第三核
酸序列，更优选所述第三核酸序列为：5’-ACAC-3’。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述第一测序接头和所述第二测
序接头分别为IonTorrent测序平台的A测序接头和P测序接头。
4.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述目标区域以及所述目标区域
对应的目标区域特异性正/反向引物序列，如下表所示：
5.一种构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1-4任一项所述的引物组合物，对待测样品包含目标区域的核酸样本进行
PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样品目标区域核酸测序文库。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一引物组与所述第二引物组的终
浓度比为1：6-10，优选1：8，
任选地，按照100nl反应体系计算，所述PCR扩增的反应体系包含：
10nl8ng/μl～20ng/ul的模板DNA；
50nl2XPCRmastermix；
10nl4μM的第二正向引物；
10nl4μM的第二反向引物；
10nl500nM第一正向引物；
10nl500nM第一反向引物，
任选地，所述PCR扩增的反应程序为：
7.一种确定待测样品目标区域核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据权利要求5或6所述的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库；
对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列，
任选地，当所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Illumina测序平台的P5测序
接头和P7测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序，
任选地，当所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为IonTorrent测序平台的A测
序接头和P测序接头时，利用IonTorrent测序平台进行所述测序。
8.一种同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步
骤：
针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地根据权利要求5或6所述的方法，构建
待测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述第二正向引物的第一核酸序列和第一测序接
头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序接头之间，进一步包含标签序
列，且所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欧，程小芳，郭凤婷，常灿坤，蒋慧，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44