核酸液相提取及检测方法技术

本发明专利技术涉及核酸液相提取及检测方法。本发明专利技术公开了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括：将生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。本发明专利技术也公开了一种检测核酸分析物的方法，该核酸分析物是用上述提取方法获得的。

Liquid phase extraction and detection of nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
核酸液相提取及检测方法本申请是国际申请日为2011年4月27日的国际申请PCT/CN2011/000746进入中国、申请号为201180049214.2的题为“核酸液相提取及检测方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及核酸的提取和检测，更具体地说，本专利技术涉及利用高压加热从生物样品中液相释放核酸和对其进行检测的方法。
技术介绍
基因检测在现代临床医学中的作用越来越重要。基因检测的第一步是从固定或未固定的生物样本中提取核酸。传统的化学方法，通常先用酶消化细胞或组织，再经有机溶剂抽提，使被分离的核酸经过酒精或异丙醇沉淀，收集并浓缩于水中。整个过程需2-3天。特别是石蜡包埋组织，还需多次二甲苯脱蜡、高浓度蛋白酶长时间消化等步骤，低时效的劣势更为突出。近些年，国内外研发了多种固相核酸提取试剂盒，原理大多为裂解细胞，释放核酸，核酸吸附于某些颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱。这些方法相对缩短了核酸提取的时间，但距离低廉高效、简单易行的目标依旧太远。随着基因检测不断上升的地位，核酸提取技术与涌现出的基因检测新方法、新技术相比较，一直没有得到同步的创新、突破。能否获得合格的核酸样本，已成为基因检测成败的关键。特别是高度依赖于石蜡包埋组织的基因型分析或诊断。
技术实现思路
本专利技术提供了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。本专利技术的方法特别适用于从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取核酸。该方法通过一步高压加热，同时完成石蜡包埋组织的脱蜡、裂解组织细胞、解交联等，直至液相释放核酸。本专利技术还提供了一种对生物样品中的核酸分析物进行检测的方法，包括按照本专利技术的方法获得所述核酸分析物的溶液，以及对所述核酸分析物进行检测，优选通过聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)进行检测。本专利技术的方法操作简单(例如目前常用的核酸提取试剂盒需要20多个步骤)，速度快，成本低，不需要特殊的设备和试剂，简单的操作方法易于掌握，大大地提高了核酸溶液制备和检测的效率。附图说明图1A显示了K-rasexon2的12密码子点突变(G12S)，5’→3’；图1B显示了同一标本的反向测序结果(3’→5’)。箭头表明突变位点。图2显示了人大肠癌K-rasexon2的12、13密码子的正常序列。图3显示了白色念珠菌荧光PCR的结果。其中纵坐标为荧光量，横坐标为PCR循环数，两条曲线为阳性结果。图4显示了人血清HBV病毒575、241、192bpHBV特异片段的电泳结果。图5显示的是一幅电泳图，其中：[1]人胃肠道间质瘤石蜡包埋组织；[2]人大肠癌石蜡包埋组织；[3]100bp标记物；[4]人新鲜甲状腺癌组织；[5]培养细胞。图6显示的是饱和蒸汽温度与压力关系对照表。具体实施方式本专利技术一方面提供了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。所述核酸分析物溶液通常可直接用于后续的检测，例如PCR。这大大简化了核酸提取的步骤。本文所用的术语“核酸分析物”是指待分析的目标核酸分子，包括DNA和RNA。当样品中待分析的核酸为看家基因时，由于其拷贝数较多，因此所获得的溶液中核酸的含量也较高，便于后续的PCR检测。当待分析的核酸拷贝数较低时，可以在采用本专利技术的方法获得核酸溶液后再进一步进行浓缩，例如通过色谱柱进行浓缩，以提高核酸浓度。本文所用的术语“任选”表示“可有可无”或“非必需”的含义。“任选地，对样品进行离心”是指可以进行离心，也可以不离心，这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。本文所用的术语“高压”是指比标准大气压更高的压力。例如，在标准大气条件下海平面的气压为一个大气压，大约相当于101.3kPa(千帕)。本专利技术中的“高压”可以通过本领域常用的高压设备来实现，例如高压锅、电压力锅、高压蒸汽灭菌锅等。最常用的高压设备是蒸汽加热设备。本领域公知，高压加热时的温度通常会比常压加热时的温度更高。本领域有多种方法用于估算高压加热时压力与温度之间的对应关系(参见例如图6所示的“饱和蒸汽温度与压力关系对照表”)。可以根据这些方法粗略估算高压加热时的大致温度。例如，蒸汽压力锅的压力为250kPa时，温度大约为127℃。本专利技术中的“高压”通常在105kPa以上，例如110kPa、115kPa。常用的蒸汽压力锅的压力上限大约为350kPa。本专利技术方法中所采用的“高压”可以在105-350kPa之间，例如110-320kPa，特别是115-250kPa，优选120-200kPa。不同的生物样本对温度和压力的耐受力是不同的。本领域技术人员可以根据待测样本的性质，通过常规试验优化出最适当的高压温度及时间。例如，当样品易于破碎时(例如肿瘤或病毒样本)，加热压力和时间可以适当降低；当生物样品难于破碎(例如白色念珠菌)时，加热压力和时间可以适当增加。根据压力和样品的不同，加热时间可以在5-210分钟范围内，例如10-90分钟，特别常用的加热时间是20-60分钟。本领域技术人员可以理解，当加热压力较低并且样品中的核酸难于释放出来时，可以采用更长的加热时间，例如4小时。例如，当对石蜡包埋组织切片样品进行处理时，典型的加热条件可以是：压力140-170kPa，维持25-45分钟。当对白色念珠菌样品进行处理时，典型的加热条件可以是：压力140-170kPa，维持45-60分钟。本文所用的术语“生物样品”是指含有核酸的待测生物材料样品，包括来自动物、植物、微生物或人体的生物样品。生物样品可以是新鲜的、冰冻的或固定的各种样品，例如人体组织活检样品、肿瘤样品、福尔马林固定的石蜡包埋组织样品，以及细菌、真菌、病毒、支原体等微生物样品。常见的新鲜的生物样品包括：生物流体样品，例如血液、血清、组织液、尿液、大便、痰液、脑脊液、唾液、眼泪、乳头吸出液和培养的细胞；肿瘤样品，例如从受试者体内取出的病变组织等。典型的固定的生物样品是10％福尔马林固定的石蜡包埋组织。本专利技术方法特别适合于石蜡包埋组织样品，包括较长期的留档蜡块及切片。在对生物样品进行加热时，可以将样品放入加热容器中。常用的加热容器包括离心管和试管，例如容量为1.5mL或10mL的带盖离心管，优选在管盖上扎孔，以防高压加热过程中气体膨胀，崩开管盖。也可以将样品放入纱布封口的锥形瓶或烧瓶中，或其它透气的容器中加热。在高压加热前，视情况，可以向生物样品中加入任选的溶解介质。例如，在对石蜡包埋组织切片进行加热前，可以加入0.1MNaOH溶液例如200μL或1ml，使样本完全浸入液体中。常用的溶解介质包括水、DEPC处理水、生理盐水、碱溶液和缓冲液等。常用的缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液等。本领域技术人员可以理解，在生物样品自身已经含有大量液体时(例如脑脊液)，也可以不再额外加入溶解介质。在高压加热本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。

【技术特征摘要】
1.从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。2.权利要求1的方法，其中所述的高压为105-350kPa，例如110-320kPa，特别是115-250kPa，优选120-200kPa。3.以上权利要求之任一项的方法，其中所述高压加热步骤的持续时间为5-210分钟，例如10-90分钟，特别是20-60分钟。4.以上权利要求之任一项的方法，其中所述生物样品选自由组织活检样品、细胞样品、肿瘤样品和生物流体样品构成的组。5.以上权利要求之任一项的方法，其中所述生物流体样品选自由血液、血清、组织液...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟镐镐，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11