一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％‑2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25‑50℃；所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种。本发明专利技术提供的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率高、易规模化生产、且富含非变性Ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。

Method for preparing cartilage extract containing non denatured type II collagen

The present invention provides a method for preparing non denatured type II collagen in cartilage extract, which is characterized in that the method comprises the following steps: degreasing, sterilization, homogenization, enzymolysis, filtering and drying; wherein, in the step of the enzyme in the slurry will be obtained in the step of the homogenate the pH is adjusted to 2.5 to 8.5, with 0.001% of the weight of 2% cartilage enzyme added cartilage weight 1/20 ~ 1/500 papaya and / or pineapple juice filtering to obtain supernatant at low temperature, hydrolysis of 12 ~ 48h, enzymolysis temperature is 25 50 DEG C; the enzyme is preferably one or several. Bacillus subtilis, protease, alkaline protease and protease in metal. The preparation method obtained by the invention has high purity of the cartilage extract, high extraction rate and easy scale production, and is rich in non denatured type II collagen and chondroitin sulfate.

【技术实现步骤摘要】
一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法
本专利技术涉及到一种软骨提取物的制备方法，特别涉及一种含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是皮肤、骨骼和关节等组织的重要的组成部分，是多细胞动物的细胞外基质的主要成分。目前从哺乳动物中已经发行27种不同类型的胶原蛋白，其中由三条相同的α链组成的Ⅱ型胶原蛋白主要存在于软骨组织中和眼玻璃体中，因此Ⅱ型胶原蛋白被视为软骨的一种结构功能性元素。目前市面在销售胶原蛋白多为经过水解后的胶原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200-20000Da的范围内。虽然这些多肽也具有一定的保持皮肤水分、增强骨密度和增强免疫力等作用，但并无预防和治疗因自身免疫机能变化引起的风湿性关节炎的功效，也不具有预防和治疗退行性关节炎的作用。非变性Ⅱ型胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的蛋白，当人体摄入非变性Ⅱ型胶原蛋白后，体内免疫细胞尤其是淋巴细胞的免疫耐受会发生改善，免疫耐受的原因是由于摄入的Ⅱ型胶原蛋白中含有抗原决定簇。抗原决定簇是抗原的一个特殊结构单元，能够被抗体识别和绑定，当抗体绑定到生物大分子时，抗体不能识别整个有机体或物质，但是能识别标位并进行绑定。活性抗原决定基被绑定在淋巴集结上作为一个组织存于小肠，去刺激免疫细胞、信息传递分子如细胞因子和参与增殖分化趋化因子并抑制细胞分泌去抑制炎症。目前国内外也有一些非变性Ⅱ型胶原蛋白的提取工艺，但或是未对其原料进行除杂等预处理、或未对杂蛋白进行处理、或是提取率低、或是保存条件受限制。
技术实现思路
本专利技术目的之一是至少克服上述缺陷中的一种，提供一种新的含非变性Ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。因此，本专利技术提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。本专利技术提供的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率高、易保存、易规模化生产，且富含非变性Ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。附图说明书图1为实施例1获得的非变性II型胶原蛋白的透射电镜图片。图2表示实施例1和2获得的II型胶原蛋白的western印迹的结果，其中左侧泳道是实施例2获得的II型胶原蛋白，右侧泳道是实施例1获得的II型胶原蛋白。具体实施方式本专利技术提供了一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。本申请的专利技术人意外发现，在上述酶解条件下进行酶解，能够获得较高浓度的非变性Ⅱ型胶原蛋白。在酶解步骤，所述酶可以采用本领域所用的任何酶，但是在一种优选的实施方式中，所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种；最优选为胃蛋白酶。在一种优选的实施方式中，所酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。在另一种优选的实施方式中，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：1。在该优选条件下，获得的软骨提取物中非变性Ⅱ型胶原蛋白浓度更高。在一种优选的实施方式中，在干燥步骤后进行粉碎，其中，脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的pH到5.5～8.5；消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为50～300目；过滤：利用5～100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液；干燥：将过滤收集的过滤液进行低温干燥，干燥温度不高于30℃，干燥后获得软骨提取物；粉碎：干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在100目-500目。在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂是NaOH溶液、KOH溶液、Na2CO3溶液、NaCl溶液、KCl溶液中的一种或几种。在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂的浓度为0.01～3重量％，所述脱脂剂与软骨的重量比为1～10:1在另一种优选的实施方式中，消毒步骤中所使用的消毒液是次氯酸钠和/或双氧水，消毒过程中消毒液的浓度控制在100ppm～2000ppm，消毒时间控制在0.2h～12h。在另一种优选的实施方式中，匀浆步骤在37℃以下进行。在另一种优选的实施方式中，低温干燥方法是滚筒烘干法、低温长网烘干法、冷冻干燥法。在另一种优选的实施方式中，在有预冷的步骤时，预冷温度不高于-10℃，干燥后软骨提取物的含水量控制在6％以下。在另一种优选的实施方式中，所述制备方法在脱脂前进行预处理，以获得更加纯净的胶原蛋白。该预处理可以按照现有技术进行，优选地该预处理包括：去除软骨原料上存在的脂肪、筋膜、残留的肉或红骨等非软骨物质，然后将其切成2mm～20mm的丁状物。在另一种优选的实施方式中，使用的原料软骨可以是鸡软骨、鸭软骨、牛软骨或其混合物。实施例1(1)预处理：选取鸡胸软骨3.5kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成3*3mm的丁状。(2)脱脂：用终0.01％浓度的Na2CO3和2％NaCl的混合脱脂剂溶液7kg，常温脱脂4h，脱脂排水后用纯化水清洗至pH6.5。(3)消毒：加浓度400ppm次氯酸钠溶液开始消毒，消毒2次，每次12h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，pH控制在6.5-7.0。(4)匀浆：将步骤(3)处理的软骨丁状物加入6kg纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液pH调节至2.5，加入70克胃蛋白酶，加入60低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和10g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度25℃进行酶解20h。(6)过滤：利用5目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。(7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-40℃，干燥过程终温度控制在30℃，冻干后获得软骨提取物。(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。采用GB5009.5的方法检测胶原蛋白含量为55.2％，采用GB/T20365检测硫酸软骨素含量为7.9％，采用ELISA方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性Ⅱ型胶原蛋白含量为11.3％。采用透射电镜检测非变性Ⅱ型胶原蛋白的形态，结果如图1所示。采用western印迹检测II型胶原蛋白，结果如图2右侧泳道所示。实施例2(1)预处理：选取新鲜鸭胸软骨20kg，解冻后除去软骨上的鸭肉、筋膜和红骨，然后利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％‑2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25‑50℃；所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种。

【技术特征摘要】
1.一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的pH调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃；所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，所述酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。3.根据权利要求1所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：1。4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，在干燥步骤后进行粉碎，其中，脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的pH到5.5～8.5；消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱青，王海燕，张贵锋，刘爽，
申请(专利权)人：北京盛美诺生物技术有限公司，海南盛美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11