靶向OLFM4基因的干扰RNA、慢病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向OLFM4基因的干扰RNA及慢病毒载体，用于制备预防、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。本发明专利技术利用所述干扰RNA不仅具有抑制胃癌细胞的体外迁移与侵袭能力，还能具有抑制胃癌细胞的肝脏转移能力；使得减弱OLFM4表达具有潜在治疗晚期胃癌恶性进展的有效方式。并进一步明确NF-kB信号为OLFM4表达的上游调控转录因子，还具有反馈调控NF-kB信号功能。

【技术实现步骤摘要】
靶向0LFM4基因的干扰RNA、慢病毒及其应用
本专利技术属于基因工程领域，主要涉及利用RNAi沉默0LFM4基因用于制备预防、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的应用。
技术介绍
胃癌是我国第二大常见恶性肿瘤，亦是癌症致死的第二大原因。尽管目前胃癌综合治疗措施不断发展完善，使得当前的治疗仍不能获得满意效果，由于多数胃癌患者在首诊时已属中晚期，进展期胃癌占住院病例90 %以上，术后5年生存率长期徘徊在30-50 %。目前研究发现多数恶性肿瘤治疗效果不佳的主要原因在于转移与复发。胃癌晚期，恶性癌细胞经侵袭发生血行播散经门静脉转移至其他器官如肝脏，导致多种脏器功能衰竭，因此胃癌侵袭与肝转移是晚期胃癌患者死亡的最主要原因之一。由此，对于胃癌的抗转移治疗现状，寻找一个治疗性靶点抑制胃癌的浸润和肝转移，将有助于改善胃癌治疗，在提高晚期胃癌患者生存率具有重要意义。从医学角度而言，肿瘤细胞无限制增殖是良性与恶性肿瘤的共同特征；而肿瘤的恶性侵袭与转移则是区分良性肿瘤与恶性肿瘤的主要特征之一。恶性肿瘤最重要的生物学特点在于恶性肿瘤不仅可在原发部位浸润生长、累及组织；而且还可通过多种途径扩散本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向OLFM4基因的干扰RNA，其核苷酸序列如下:正义链：5′‑CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG‑3′，即SEQ ID NO.1；反义链：5′‑AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT‑3′, 即SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种祀向0LFM4基因的干扰RNA,其核苷酸序列如下: 正义链:5,-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3 '，即 SEQ IDN0.1 ； 反义链办’-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'，即 SEQ IDN0.2。2.包含权利要求1所述的靶向0LFM4基因的干扰RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒载体的结构如图1所示。3.如权利要求2所述的Lentivirus慢病毒,制备方法包括以下步骤: (1)体外合成上述DNA序列； (2)退火配对产生DNA双链，通过两端所含的酶切位点AgeI与EcoRI连入酶切后的GVl 15载体； (3)将连接产物转 入制备好的细菌感受态细胞，抽提DNA重组质粒；DNA测序验证阳性重组克隆； (4)Lentivirus 病毒包装: ①转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X IO7细胞/20 ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37°C、5% CO2培养箱内培养，24 h后待细胞密度达70%~80%用于转染； ②转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基； ③向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μ g , pHelper 1.0载体15 μ g，pHelper 2.0载体10 μ g)，与相应体积的Opt1-MEM培养基混合均匀，调整总体积为2.5 ml,在室温下温育5分钟； ④将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，吸取100μ I Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opt1-MEM混合，在室温下温育5分钟； ⑤把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地颠倒混匀，在5分钟之内混合； ⑥混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物； ⑦将DNA与Lipofectamine2000混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄轶，宋利华，李阳，包黎明，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85