用于同时测定多种凝固蛋白酶的方法技术

本发明专利技术涉及用于在单一测试反应中同时测定多种凝固蛋白酶活性或者同时测定多种凝固蛋白酶抑制的生色方法。为了这一目的，使用两种生色底物，所述底物具有不同的最大吸收并且所述底物的颜色信号可以被光谱学分开。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于凝固诊断学领域并涉及用于同时测定多种凝固蛋白酶活性的方法或用于同时测定多种凝固蛋白酶的抑制的方法。
技术介绍
已建立的抗凝治疗的主要目标在于抑制促凝的凝固因子凝血酶(因子IIa)和因子 Xa。在例如导致凝固因子合成抑制的利用诸如华法灵钠的维生素K拮抗剂的口服抗凝与通过抑制血流中活性凝固因子的抗凝之间作出了区别。在抑制或失活血流中活性凝固因子的抗凝剂的情况下，在具有直接作用的抗凝剂和具有间接作用的那些之间作出了区别。具有直接作用的抗凝剂如例如利伐沙班(rivaroxaban)、达比加群或美拉加群结合凝血酶或因子Xa，并因此具有高度的特异性。具有间接作用的抗凝剂如例如肝素结合内源性凝固因子抑制剂例如抗凝血酶，并数倍强化其抗凝作用。抑制血流中活性凝固因子的所有抗凝剂都以特异性失活模式为特征。特定的物质类型如例如未分级分离的、高分子量肝素既抑制凝血酶又抑制因子Xa。其他物质具有高度特异性作用，即，或者抑制凝血酶(例如，水蛭素、达比加群、美拉加群)，或者抑制因子Xa (例如，戍糖如磺达肝素(fondaparinux )、利伐沙班)。在血栓栓塞性疾病的治疗过程期间，有时会更换抗凝剂。当治疗腿部深静脉血栓时，经典的情况是从肝素(抑制血流中凝血酶和因子Xa)转换为华法灵钠(抑制肝脏中凝固因子合成)。随着治疗中的这种变化，血流中凝血酶和因子Xa的相对失活可改变。对于治疗的控制和药物的给药，知晓凝血酶和因子Xa的活性或抑制是重要的。因此，能够可靠地测定患者血液中活性凝固因子凝血酶和因子Xa的活性或抑制是必要的。在凝固诊断学中，在用于检查凝血级联功能性的“总体测试”和用于测定个别凝血因子活性的“个别测试”之间作出了区别。对于总体测试和个别测试均已知不同的测试形式。在测试形式方面，在凝固测试和生色测试之间基本上作出了区别。在生色测试中，将通常由血浆组成的待测患者样品与凝固激活剂和凝固因子的底物混合。由于大多数凝血因子是丝氨酸内肽酶，即可以切割肽键的水解酶，因此主要使用被待测凝血因子高度特异性切割并且具有可检测信号基团的肽底物。优选地，使用可切割的生色或荧光信号基团，其通过光度法进行测定。专利文献EP 0034122 Al和US 4，508，644 描述了许多生色肽底物及其在凝固诊断测试中的应用，例如用于测定蛋白水解凝固因子因子IIa (凝血酶)和Xa。文献EP 0078764 Al描述了用于测定蛋白水解凝固因子XIIa的生色方法。特别地，生色测试还可以用于测定抑制患者样品中凝血因子活性的抗凝剂。对于这种目的，通常将待测患者样品与活化的凝固因子和所述凝固因子的底物混合。样品中存在的抗凝剂越多，活化凝固因子的抑制越强并且切割的底物越少。已建立的并且也市售的生色测试特别地使用生色团对-硝基苯胺(pNA)和5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)，其在405 nm有最大吸收。通常利用光度法测定产生的黄色。当测定抗凝剂时，测试反应中的颜色浓度与样品中抗凝剂浓度成反比。为了测定凝血酶和因子Xa的抑制，进行两个单独的测试是必要的，其中在每种情况下测定两种凝固因子中的一种的抑制。在单一测试反应中同时测定两种凝固因子的活性或抑制将是期望的。这将具有下列优势减少材料消耗和时间支出，以及在相同条件下进行两种测定、避免进行测试时的变化如例如移液误差，其可能导致在测定两个结果之间关联中的误差。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供允许在单一测试反应中同时测定凝血酶和因子Xa的方法。WO 2006/072602 Al描述了用于同时测定凝血酶和纤溶酶的方法，其中使用荧光底物，纤溶酶是纤维蛋白溶解系统的酶。本专利技术目的是通过将样品与第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合实现的，其中第一生色底物具有生色团， 该生色团的最大吸收与第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。产生的生色信号可以在光谱学上分开并可以用光度法在不同波长彼此独立地测定。因此，本专利技术提供用于在单一测试反应中同时测定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子的活性的方法，其中将样品与第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合，并且其中用光度法测定在测试反应中的吸收变化(颜色信号形成)，并且其中第一生色底物具有生色团，该生色团的最大吸收与第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。附图说明图I是显示富集不同浓度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血浆样品中因子Xa活性的抑制[%](参见实施例2)的条形图。在405nm波长处测定具有ANBA生色团的因子Xa 特异性肽底物的切割。不考虑阿加曲班浓度(凝血酶抑制剂)，在具有升高的利伐沙班浓度 (因子Xa抑制剂)的样品中测定到升高的因子Xa抑制。图2是显示富集不同浓度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血浆样品中凝血酶活性的抑制[%](参见实施例2)的条形图。在575nm波长处测定具有碱性蓝49生色团的凝血酶特异性肽底物的切割。不考虑利伐沙班浓度(Xa因子抑制剂)，在具有升高的阿加曲班浓度(凝血酶抑制剂)的样品中测定到升高的凝血酶抑制。具体实施方案术语“蛋白水解凝固因子”应当理解为意味着在哺乳动物、优选人凝血系统中具有促凝(凝固促进的)、抗凝(凝固抑制的)或纤维溶解(凝块降解的)功能的任何血浆丝氨酸蛋白酶。促凝的蛋白水解凝固因子是例如因子IIa (凝血酶)、因子Vila、因子IXa、因子Xa、 因子XIa、以及因子Xlla。抗凝的蛋白水解凝固因子是例如蛋白Ca (活化的蛋白C)。纤维溶解的蛋白水解凝固因子是例如纤溶酶。术语“同时测定”应当理解为意味着在单一测试反应中测定两种蛋白水解凝固因子。在本专利技术的上下文中，“样品”应当理解为意味着可疑包含待测蛋白水解凝固因子或一种或多种待测抗凝剂的材料。术语“样品”特别地包含人或动物体液、尤其是血液和血浆。“蛋白水解凝固因子特异性的生色底物”应当理解为意味着被蛋白水解凝固因子以足够特异性转化的底物，其中生色团作为特异性底物转化的结果被释放。可切割底物、特别是对于活化凝固因子具有至少一个切割位点的底物是本领域技术人员充分知晓的。可切割底物可以是通过活化蛋白水解凝固因子的作用分解成两个切割产物的分子，该分子是合成、重组或使用生物技术方法制备的分子或是天然的分子。可切割底物可以完全或部分由肽组成。优选地，它包含至少在切割位点区域中的肽部分。优选地，可切割底物的肽部分由 3至大约150个氨基酸残基组成。专利文献EP 0034122 Al和US 4，508，644描述了许多生色肽底物、它们的制备、以及它们在凝固诊断学测试中的应用，例如用于测定凝固因子因子 IIa (凝血酶)和Xa。文献EP 78764 Al描述了用于测定凝固因子XIIa的生色方法。“生色团”应当理解为意味着可以通过特异性蛋白水解凝固因子的作用从底物中切割(解离)的以及在底物切割后具有与未切割状态下不同的吸收性质的信号基团(“标记”)。依照本专利技术，第一生色底物具有生色团，切割后该生色团的最大吸收与切割后第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。表I显示已知生色团的选择，它们切割后的最大吸收，以及最大吸收彼此相差至少100 nm的生色团的优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2010.12.20 EP 10195869.21.用于在单一测试反应中同时测定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子活性的方法，其中将样品与所述第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物以及所述第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合，并且其中用光度法测定所述测试反应中的吸收变化，其特征在于所述第一生色底物具有生色团，所述生色团的最大吸收与所述第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。2.如权利要求I所述的方法，其中所述第一蛋白水解凝固因子和所述第二蛋白水解凝固因子选自包含凝血酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子Xlla、蛋白Ca以及纤溶酶的集合。3.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是凝血酶。4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是因子Xa。5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有对-硝基苯胺或5-氨基-2-硝基苯甲酸作为生色团。6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有 phenoxazime衍生物作为生色团。7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一蛋白水解凝固因子和所述第二蛋白水解凝固因子存在于所述样品中，并且通过添加一种或多种用...

【专利技术属性】
技术研发人员：N灿德尔，
申请(专利权)人：西门子医疗诊断产品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：