测定生物样品中蛋白酶的方法技术

一种测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，其中样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，样品中所存在组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂从样品中耗尽或其抑制剂功能受遏制，且蛋白酶抑制剂从组织蛋白酶B抑制形式中退出，然后测定样品中活性组织蛋白酶B的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，和能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且其蛋白酶活性在样品中被蛋白酶抑制剂抑制的组织蛋白酶B形式。
技术介绍
为了测定组织提取物或体液如血清中的酶浓度，可用酶检测和免疫学试验如ELISA。在医学分析和临床诊断情况中，测定样品中完整和活性酶的存在量通常很重要，从而能说明病因学、疾病效果和预后。酶的永久失活形式如变性酶或酶片段通常不相关，因而不考虑测定这种酶且一般应该不考虑。然而，其他失活酶形式如其活性短暂且由抑制剂或酶前体可逆性抑制的酶(称为酶原)可在疾病成因、影响和/或预测中发挥决定性作用。如果生物学过程需要其酶活性，这种失活酶形式可在某些情况下转变成其活性形式。在这些情况中，例如，所述抑制剂通过某些机制灭活或从酶中撤出，或者酶原转变为其活性形式。组织或体液中活性和短暂失活酶的总体浓度对于特定疾病有重要启示。测定酶浓度的酶检测使用由活性酶进行或催化的这类反应。然而，如果所述酶形式也能包括在内，作为暂时 抑制失活形式和/或作为失活酶原在生物样品中可用(例如，这通常是用蛋白酶的情况)，则这些酶形式由于其失活而不能用这类测试检测。因此，样品中可测量的酶活性通常不与真正可用的酶活性对应，因为至少一部分酶活性由抑制剂抑制或以酶原的失活形式存在。熟知在感染癌症的癌症患者组织样品中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B水平相较健康人的对应组织样品增加。因此，认为组织蛋白酶B是癌症疾病中的诊断和预后因子。一部分组织蛋白酶B是胱抑素抑制形式。此情况中考虑的半胱氨酸蛋白酶抑制剂属于半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，来自I家族的胱抑素A和胱抑素B在胞内有活性，来自II家族的胱抑素C在胞外有活性，因此在血清中也如此。W097/00969中，对于组织蛋白酶B浓度的酶学测定，建议在组织样品中通过亲和色谱从受抑制组织蛋白酶B中撤出半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制剂，其中生物样品通过填充有琼脂糖凝胶的亲和色谱柱，木瓜蛋白酶共价结合所述琼脂糖凝胶。木瓜蛋白酶也是半胱氨酸蛋白酶且对半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的结合亲和性高于组织蛋白酶，因此木瓜蛋白酶从组织蛋白酶中撤出抑制剂。然后，去抑制组织蛋白酶B的活性用其酶活性测量。不同于组织样品，血清中观察到组织蛋白酶B在没有去抑制时不能测量。因此，推断全组织蛋白酶B在血清中受抑制。通过直接ELISA测量显示前列腺癌患者血清中组织蛋白原B (组织蛋白酶B的酶原)和组织蛋白酶B的累积值相较健康人的对应值增加约3倍，而同一时间血清中在测量前去抑制的组织蛋白酶B活性相较健康人仅高约30%。通过夹心ELISA方法，结肠癌患者血清中组织蛋白酶B和组织蛋白原B浓度的累积值相较健康人增加约5倍。因此，推断组织蛋白原B浓度或组织蛋白酶B和组织蛋白原B浓度的累积值相较单独组织蛋白酶B值是更重要的癌症疾病指示物。在免疫学试验如ELISA中，样品中的酶分子通过抗体方法特异性检测。尽管免疫学试验一般比酶检测更灵敏，但抗体不区分酶活性形式与受抑制剂抑制的酶形式；因此这些免疫学试验检测活性和受抑制酶的累积量。根据这些免疫学试验所用的抗体，还能检测酶原、永久性失活酶且一定程度上也能检测变性酶。由于在酶基础上评价疾病的成因、影响和预后通常取决于活性或可激活的酶，因为仅这些酶形式最终激发或催化生物学过程，还检测永久性失活酶形式的这些免疫学试验可对所用试验的需要意义产生负影响，并因此仅部分符合医学分析和诊断。另外，免疫学试验通常需要设备和时间上的高消耗并因而成本高且一般仅在医疗机构特殊实验室中进行。专利技术目的因此，本专利技术的任务是提供测定与癌诊断特别相关的蛋白酶组织蛋白酶B的方法，所述方法相较熟知的免疫学方法更符合成本效益且运行更简单，同时适于通过抑制剂可逆抑制组织蛋白酶B和组织蛋白原B在生物样品中具体在血浆或血清中测定活性组织蛋白酶B，并通过检测永久性失活组织蛋白酶B来避免误差。专利技术描述所述任务通过测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法来解决，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，和能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，有下列步骤 a)通过以下方式将样品中存在的组织蛋白原B通过以下方式转变成组织蛋白酶B活性形式a.1)将所述样品接触第一酶(蛋白水解酶)，所述第一酶的功能性是通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，或a.1i)降低pH值到某一值，在该处组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，b)通过将所述样品接触第二酶(抑制剂结合酶)来耗尽所述样品中组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂或阻遏其抑制剂功能并从组织蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制剂，所述第二酶能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中b.1)所述第一酶(蛋白水解酶)和所述第二酶(抑制剂结合酶)是相同的酶，前提是所述酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，或b.1i)若使用，所用的第二酶(抑制剂结合酶)不同于所述第一酶(蛋白水解酶)，其中-第二酶(抑制剂结合酶)是没有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或-第二酶(抑制剂结合酶)是有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，第二酶降解组织蛋白酶B的该蛋白水解活性在样品中于步骤b)的反应时间后失活，或第二酶从样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的活性但能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，c)将样品接触组织蛋白酶B的底物并记录由蛋白酶组织蛋白酶B催化的底物蛋白水解反应。本专利技术中，术语生物样品中组织蛋白酶B的“潜在可用活性”指可用的组织蛋白酶B活性，如果出现样品中存在的组织蛋白酶B活性形式，组织蛋白酶B的短暂失活形式如组织蛋白原B和组织蛋白酶B的可逆抑制形式转变成活性形式。测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的本专利技术方法是基于以下事实生物样品中的所有组织蛋白酶B活性形式以及能被激活的形式，即组织蛋白酶B活性形式、由蛋白酶抑制剂可逆抑制的组织蛋白酶B形式、和生物学前体组织蛋白原B，首先转变成活性形式，然后进行对组织蛋白酶B特异的酶促反应，底物特异于组织蛋白酶B。因此，本专利技术方法的第一步骤a)中，组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式。这优选酶促进行，其中使样品接触第一酶(蛋白水解酶)，所述第一酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能。或者，样品中的组织蛋白原还能通过降低PH值来转变成组织蛋白酶B活性形式。如此，通常生理pH值范围为6-8的样品必须设置成3. 5-5. 5范围的较低pH值，优选4. 0-5. O范围，特别优选约4. 5，其中组织蛋白原B的前区域被切割。在前面专利技术方法的一个优选实施方式中，第一酶(蛋白水解酶)具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能并与样品接触，所述第一酶是缺乏降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的水解酶，优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D或组织蛋白酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.02 DE 102010025970.51.一种测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，所述方法有下列步骤 a)通过以下方式将所述样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式 a.1)将所述样品接触第一酶(蛋白水解酶)，所述酶的功能性是通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，或 a.1i)将pH值降低到某一值，在该处组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式， b)通过将所述样品接触第二酶(抑制剂结合酶)来耗尽所述样品中组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂或阻遏其抑制剂功能并从组织蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制剂，所述第二酶能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中 b.1)所述第一酶(蛋白水解酶)和所述第二酶(抑制剂结合酶)是相同的酶，前提是所述酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B， 或 b.1i)若使用，所用的第二酶(抑制剂结合酶)不同于所述第一酶(蛋白水解酶)， 其中 -第二酶(抑制剂结合酶)是没有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或 -第二酶(抑制剂结合酶)是有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，所述第二酶降解组织蛋白酶B的该蛋白水解活性在所述样品中于步骤b)的反应时间后失活，或所述第二酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的活性但能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B， c)将所述样品接触组织蛋白酶B的底物并记录由蛋白酶组织蛋白酶B催化的底物蛋白水解反应。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能的所述第一酶(蛋白水解酶)是没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D或组织蛋白酶C或嗜热菌蛋白酶或链霉蛋白酶，特别优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D，且所用的第二酶(抑制剂结合酶)不同于第一酶(蛋白水解酶)。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的第二酶(抑制剂结合酶)是木瓜蛋白酶，具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在所述样品中于反应时间后活化或木瓜蛋白酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用的第一酶(蛋白水解酶)和第二酶(抑制剂结合酶)是相同的酶，即木瓜蛋白酶，其具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能并且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在反应时间后活化或木瓜蛋白酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述样品中的木瓜蛋白酶在反应时间后转化成改性木瓜蛋白酶，所述改性木瓜蛋白酶就组织蛋白酶B降解而言具有失活的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·J·迈耶，H·J·莫克，
申请(专利权)人：帕普斯特许可有限两合公司，
类型：
国别省市：