一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成。与Neutral-PAGE酶谱法相比，本方法不但能够很好的检测SDS敏感蛋白酶的活性，且能确定蛋白酶的分子量大小，并克服普通酶谱方法酶活条带易呈点状扩散，形成重叠的缺陷，提高酶谱的分辨率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物蛋白酶检测
，具体涉及一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法。
技术介绍
酶谱法(zymography)是一种在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术的基础上通过特异性底物和丙烯酰胺共聚合来测定酶活性的电泳检测技术。明胶酶谱法是测定蛋白酶活性的一种常用手段，因该技术能测定多种降解明胶的蛋白酶活性，且具有方法简单、 检测结果直观和定量等优点，近年来被广泛应用于生物蛋白酶检测
然而，大量的检测数据显示该方法仍存在一些缺点。如1、缺乏一种能够适用于多数蛋白酶的通用方法。2、缺乏特异性更高且能和丙烯酰胺偶联的底物。3、难以测定一些 SDS敏感蛋白酶的活性。4、难以测定一些含碱性蛋白酶的组分的活性。相关文献相关的美国专利包括7，153，660 B2, US2003/0171271 Al。相关日本专利包括 JP20010023781, JP20010131, JP20040299951, JP20041014。相关文献包括Choi NS et al. ， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS, 2000，Biosci.，Biotechnol. , Biochem. 64:1722—1725; Cristiane Μ. C. de Salles et al. , 2006, Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle, 1980， Anal. Biochem. 102:196—202; Eiichi Saitoh et al. ， 2007， Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH, 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al. , 2005, J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz, 2009, Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al., 2009, Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al. , 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al. ， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and Jff Von den Hoff, 2005， BIOTECHNIQUES 38:73—83; Choi NS et al. ， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537—543; R. Porcel et al. ， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576； A Granel1i-Piperno and E Reich, 1978, J. Exp. Med. ； TM Leber and FR Balkwill, 1997，249:24-28;骞爱荣等，2003，解放军医学杂志，28 =282-283;姜微波等，2002，植物学通报，19:607-610。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于解决酶谱测定时SDS敏感酶活性难以检测的问题，提供了一种用来测定SDS敏感蛋白酶的明胶酶谱方法。技术方案一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6. 67%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比0. 133%，pH 6.8; (2)浓缩胶缓冲液为0.5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6.8;聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13. 33%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比0. 133%、明胶质量体积比 0. 133%，pH 8.8;分离胶缓冲液为1.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8;上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I 聚丙烯酰胺凝胶11=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。所述电泳缓冲液中含有0. 5%0 SDS。凝胶制好后，按照生物化学常规电泳方法制备所需要的其它溶液，并参照常规操作或根据情况适当调整进行蛋白酶电泳和酶谱分析。本专利技术可以应用于微生物、植物和动物体中得到的SDS敏感蛋白酶或普通蛋白酶的电泳和酶谱分析。有益效果与Neutral-PAGE酶谱法相比，Neutral-PAGE酶谱法只能定性的观测蛋白酶活力，并不能准确测定蛋白酶的分子量大小。本方法不但能够很好的检测SDS敏感蛋白酶的活性，且能确定蛋白酶的分子量大小，并克服普通酶谱方法酶活条带易呈点状扩散， 形成重叠的缺陷，提高酶谱的分辨率。附图说明图1本方法测SDS敏感蛋白酶活性(泳道1)和基于非变性凝胶电泳的蛋白酶谱测定SDS敏感蛋白酶活性(泳道幻结果比较。符号M下面的数字是蛋白质分子量标记，单位是千道尔顿(KD)。图1 (泳道1)简称为图1 (1)，图1 (泳道2)简称为图1 (2)。图2酶谱测定层析纯化组分蛋白酶活性。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。图3层析纯化组分SDS-PAGE图谱，作为图2的对照。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。图4三株高温菌胞外蛋白酶的酶谱比较。(a)图为使用本方法检测得到的结果， (b)为使用基于SDS变性蛋白电泳(SDS-PAGE)的酶谱方法检测得到的结果。具体实施方式实施例中所述的质量体积比单位为g/mL，体积比单位为mL/mL。实施例1 现采用该方法，对一株芽胞杆菌分泌的SDS敏感蛋白酶的粗酶液进行了酶谱检测，比较了不同方法对该菌株的发酵液进行酶谱分析的差异，作为该方法检测实例。菌株一株地衣芽孢杆菌(CGMCC No. 1. 807)，这些菌株均为普通微生物保藏中心可以购买到的菌株。培养条件55°C培养M小时。发酵产酶条件基础培养基30°C培养48小时左右。样品制备用基础培养基发酵地衣芽孢杆菌(CGMCC No. 1. 807)，培养48小时后将菌液离心收集粗本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种测定ＳＤＳ敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，其特征在于电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成：ａ． 聚丙烯酰胺凝胶Ｉ由３质量份丙烯酰胺混合溶液Ｉ和１质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：（１）丙烯酰胺混合溶液Ｉ由丙烯酰胺、过硫酸铵、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为６．６７％、过硫酸铵质量体积比０．１３３％、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）质量体积比０．１３３％，ｐＨ６．８；（２）浓缩胶缓冲液为 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ溶液，ｐＨ ６．８；ｂ． 聚丙烯酰胺凝胶ＩＩ由３质量份丙烯酰胺混合溶液ＩＩ和１质量份分离胶缓冲液组成，其中：（１）丙烯酰胺混合溶液ＩＩ由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为１３．３３％、过硫酸铵质量体积比０．１３３％、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）质量体积比０．１３３％、明胶质量体积比０．１３３％，ｐＨ ８．８；（２）分离胶缓冲液为 １．５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ溶液，ｐＨ ８．８；ｃ． 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶Ｉ：聚丙烯酰胺凝胶ＩＩ＝２：５，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。...
【技术特征摘要】
2010.12.30 CN 201010614263.31.一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，其特征在于电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成a.聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成， 其中(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6. 67%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、 N，N，N'，N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比 0. 133%，pH 6. 8;(2)浓缩胶缓冲液为0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6. 8;b.聚丙烯酰胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：王一明，朱泓，林先贵，
申请(专利权)人：中国科学院南京土壤研究所，
类型：发明
国别省市：84
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