一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法技术

一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成。本发明专利技术提供的方法，解决了用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到碱性蛋白酶活性的问题。本方法能够有效专一灵敏的检测碱性蛋白酶活力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物蛋白酶检测
，具体涉及。
技术介绍
酶谱法(zymography)是一种在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术的基础上通过特异性底物和丙烯酰胺共聚合来测定酶活性的电泳检测技术。明胶酶谱法是测定蛋白酶活性的一种常用手段，因该技术能测定多种降解明胶的蛋白酶活性，且具有方法简单、 检测结果直观和定量等优点，近年来被广泛应用于生物蛋白酶检测
然而，大量的检测数据显示该方法仍存在一些缺点。如1、缺乏一种能够适用于多数蛋白酶的通用方法。2、缺乏特异性更高且能和丙烯酰胺偶联的底物。3、难以测定一些 SDS敏感蛋白酶的活性。4、难以测定一些含碱性蛋白酶的组分的活性。相关文献相关的美国专利包括7，153，660 B2, US2003/0171271 Al。相关日本专利包括 JP20010023781, JP20010131, JP20040299951, JP20041014。相关文献包括Choi NS et al. ， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS, 2000，Biosci.，Biotechnol. , Biochem. 64:1722—1725; Cristiane Μ. C. de Salles et al. , 2006, Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle, 1980, Anal. Biochem. 102:196-202; Eiichi Saitoh et al. , 2007, Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH, 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al. , 2005, J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz, 2009, Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al., 2009, Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al. , 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al. ， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and Jff Von den Hoff, 2005， BIOTECHNIQUES 38:73—83; Choi NS et al. ， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537—543; R. Porcel et al. ， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576； A Granel1i-Piperno and E Reich, 1978, J. Exp. Med. ； TM Leber and FR Balkwill, 1997，249:24-28;骞爱荣等，2003，解放军医学杂志，28 =282-283;姜微波等，2002，植物学通报，19:607-610。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于解决酶谱测定时碱性蛋白酶活性难以检测的问题，对现有基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)基础上的酶谱方法进行了改进，提供了一种检测碱性蛋白酶活性的方法。该方法的效果要明显好于用增加电泳时间来检测碱性蛋白酶的酶谱改进方法。技术方案本专利技术的技术方案为，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成a.聚丙烯酰胺凝胶I由7质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成， 其中(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6. 67%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比0. 133%。(2)浓缩胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2. 7%，冰乙酸体积比为2. 87%，ρΗ6· 7。b.聚丙烯酰胺凝胶II由7质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中(1)丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13. 33%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比0. 133%、明胶质量体积比 0. 133%。(2)分离胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2. 7%，冰乙酸体积比为17. 2%，ρΗ4· 3。c.上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I 聚丙烯酰胺凝胶11=2 5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。本专利技术的技术方案所述的测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，样品缓冲液中含有质量体积比为1%的十六烷基三甲基，体积比为25%的甘油，质量体积比为0. 002%甲基绿，体积比为12. 5%浓缩胶缓冲液，ρΗ6· 7。凝胶制好后，按照生物化学常规电泳方法制备所需要的其它溶液，并参照常规操作或根据情况适当调整进行蛋白酶电泳和酶谱分析。本专利技术可以应用于微生物、植物和动物体中得到的碱性蛋白酶的电泳和酶谱分析。有益效果本专利技术提供了一种检测碱性蛋白酶活性的方法，解决了用普通 SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到碱性蛋白酶活性的问题。本方法能够有效专一灵敏的检测碱性蛋白酶活力。附图说明图1基于SDS-PAGE的酶谱法测定碱性蛋白酶活性(泳道Α、Β)。图1 (泳道Α)简称为图1 (Α)，图1 (泳道B)简称为图1 (B)。图2基于SDS-PAGE的酶谱法测定非碱性蛋白酶和碱性蛋白酶活性。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。图2 (泳道A)简称为图2 (A)，该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图2 (泳道B)简称为图2 (B)，该泳道蛋白为碱性蛋白酶。图3本方法检测碱性蛋白酶的活性。图3 (泳道A)简称为图3 (A)，该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图3 (泳道B)简称为图3 (B)，该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图3 (泳道C) 简称为图3 (C)，该泳道蛋白为碱性蛋白酶，图3 (泳道D)简称为图3 (D)，该泳道蛋白为碱性蛋白酶。具体实施例方式文中所述质量体积比单位为g/mL，体积比单位为mL/mL。实施例1 现采用该方法，对蛋白酶粗酶液经层析纯化后各组分进行酶谱检测，并比较了不同方法对不同蛋白酶组分分析的差异，作为该方法检测实例。菌株一株地衣芽孢杆菌(CGMCC No. 1. 807)，这些菌株均为普通微生物保本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，其特征在于电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成：ａ．　聚丙烯酰胺凝胶Ｉ由７质量份丙烯酰胺混合溶液Ｉ和１质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：（１）丙烯酰胺混合溶液Ｉ由丙烯酰胺、过硫酸铵、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为６．６７％、过硫酸铵质量体积比０．１３３％、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）质量体积比０．１３３％；（２）浓缩胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为２．７％，冰乙酸体积比为２．８７％　，ｐＨ６．７；ｂ．　聚丙烯酰胺凝胶ＩＩ由７质量份丙烯酰胺混合溶液ＩＩ和１质量份分离胶缓冲液组成，其中：（１）丙烯酰胺混合溶液ＩＩ由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为１３．３３％、过硫酸铵质量体积比０．１３３％、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基二乙胺（ＴＥＭＥＤ）质量体积比０．１３３％、明胶质量体积比０．１３３％；（２）分离胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为２．７％，冰乙酸体积比为１７．２％　，ｐＨ４．３；　ｃ．　上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶Ｉ：聚丙烯酰胺凝胶ＩＩ＝２：５，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。...

【技术特征摘要】
2010.12.30 CN 201010614261.41.一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，其特征在于电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成a.聚丙烯酰胺凝胶I由7质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成， 其中(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6. 67%、过硫酸铵质量体积比0. 133%、 N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)质量体积比0. 133%;(2)浓缩胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为 2. 7%，冰乙酸体积比为2. 87%，ρΗ6· 7 ；b.聚丙烯酰胺凝胶II由7质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱泓，林先贵，王一明，
申请(专利权)人：中国科学院南京土壤研究所，
类型：发明
国别省市：84