本发明专利技术公开了一种提取蜈蚣酸性蛋白的方法，它包括有以下步骤：ａ．将蜈蚣细粉，加入无水乙醇脱脂，在冰水浴中超声波振荡，过滤；ｂ．取滤渣，加入磷酸盐缓冲液，在冰水浴中超声波振荡，渗漉提取，渗漉液离心获取上清液，上清液过滤；ｃ．将滤液置于半透膜中，浓缩透析留取浓缩液；用磷酸溶液调节浓缩液的ｐＨ值至偏酸性后，真空再次浓缩；ｄ．将浓缩液加入无水乙醇至醇浓度达４０～５０％，离心获取半固体状沉淀，该沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解后，冷藏。本发明专利技术方法提取的蜈蚣酸性蛋白药理活性高。本发明专利技术同时公开了用本发明专利技术方法提取蜈蚣酸性在制备预防心力衰竭药物中的应用；在制备抑制心肌纤维化药物中的应用。在制备抑制心肌肥厚药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从动物中提取酸性蛋白的方法和所提取的酸性蛋白的应 用，具体地说是提取蜈蚣酸性蛋白的方法和用该方法提取的蜈松酸性蛋白在制 备治疗心脏病药物中的应用
技术介绍
蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物，始载于《神农本草经》。中 国传统医药学认为，蜈蚣其性味辛，温，有毒；具有熄风止痉，解毒散结，通 络止痛的功效。在传统医学应用中，蜈蚣常常用于治疗小儿惊风、破伤风、风 癣、疮疡、肿毒、烫伤等疾病。近年来对蜈蚣的研究颇多，其药理活性主要表 现为抗衰老作用；抗炎、镇痛、抑菌作用；改善心肌缺血、微循环，降低血 压；增强消化功能；抗惊厥；抗肿瘤；(韩双红.蜈蚣的研究进展.天津药学. 2002.14 (5)13)。目前尚未发现蜈蚣用于预防心力衰竭以及抑制心肌纤维化、抑 制心肌肥厚的文献报道。而心肌纤维化是冠心病、心肌梗死、高血压、心肌病 等多种常见心脏疾病向终末期心脏病发展的一个必然过程，如何阻止和逆转心 肌纤维化越来越受到人们关注。另外，在实际临床应用中，蜈蚣极少被单独使 用，究其原因可能与蜈蚣的应用方法有关。目前，在临床应用中，蜈蚣通常是 采用干燥全虫入药，也有采用干燥全虫经水煎提取或醇提取后入药的。事实上 无论是采用蜈蚣的干燥全虫还是蜈蚣的水提液或醇提液，其所应用的实际是蜈 蚣所有化学成分的混合物。现代药学研究表明，蜈蚣的水煎提取物和醇提取物 中含有多种氨基酸、小分子肽、淄醇等。蜈蚣体内油脂物中含有大量的脂肪 酸。采用电泳和薄层法还可分离出磷脂、胆淄醇、游离脂肪酸、三甘油酯、胆 脑垸酯、沙烯、酯酶、生物碱、茶胺等多种成分。(多棘蜈蚣化学成分研究. 中国药学杂志.1997.32(4):202 )。在蜈蚣众多的化学成分中，如何筛选、分离、提取出最具药理活性的有效成分已成为人们研究的热点和重点。曾红等人 曾将蜈蚣脱脂处理后，经sephadex G-25sephadex G-150两次柱层析，分离出8 种具有抗癌活性的组分，并经药理实验表明其中的El、 E6两种组分抗癌活性最强。(沈阳药科大学制药工程学院.曾红.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中医杂志.2004. 20(5). 57)。许鸣镝等人将少棘巨蜈蚣经95%乙醇脱脂后的水 提液低温旋转浓縮,冻干，后经过SephadexG-25柱，等电聚焦制备电泳，再经 SephadexG-150柱,SephadexG-lOO柱，最后经HPLC制备得到一个命名为SSmp-d. 纯的碱性蛋白。其分子量为24.64kD，正F-HPCE显示其等电点为9.27，氨基酸 分析表明SSmp-d含较多的Arg、 Lys等碱性氨基酸。药理实验表明 IC50=20~30Lgml时,蜈蚣总碱性蛋白对人口腔上皮细胞鳞癌(KB细胞)和人结肠 癌细胞(HCT细胞)有明显的抑制作用，且活性稳定。(许鸣镝.柳雪枚.蜈蚣碱性 蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定.生物化学杂志.1997.13(5): 586)。由此可见，不同的提取方法可以从蜈蚣中提取出具有不同药理活性的 有效成分。因此，许多研究人员都在对此进行积极的探索。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种分离提取蜈蚣酸性蛋白的方法以及该酸性蛋白 在制备心脏病药物中的应用。本专利技术的目的是这样实现的 本专利技术方法包括有以下步骤a、 将蜈蚣细粉，加入无水乙醇脱脂，在冰水浴中超声波振荡15 30分 钟，过滤，留取滤渣；b、 取滤渣，加入磷酸盐缓冲液，在冰水浴中超声波振荡1.5 2.5小时后， 在一10 5"C渗漉提取12 14小时，渗漉液在2 4。C下用离心机离心获取上清 液，上清液经纸浆滤饼过滤，留取滤液；c、 将滤液置于半透膜中，放在置有重蒸馏水的容器中，浓縮透析10 14 小时，每1 2小时更换一次水；浓縮液用磷酸溶液调节pH值至偏酸性后，于 4(TC下真空浓縮；d、 将浓縮液在0 6TM氏温下缓慢加入无水乙醇至醇浓度达40 50%，放 置10 14小时后，在0 4"C用离心机离心获取半固体状沉淀，该沉淀用中性 磷酸盐缓冲液溶解后，冷藏。本专利技术方法中优选的工艺参数是a步骤中所说的超声波振荡时间为30分钟；b步骤中所说的超声波振荡时 间为2小时；c步骤中所说的磷酸溶液的浓度为lmol/L 2mol/L，浓縮透析时 间为12小时；d步骤中所说的至醇浓度为40W。本专利技术方法可有效分离、提取出蜈蚣中所含的酸性蛋白，且用该方法所分 离、提取的蜈蚣酸性蛋白质杂质少、纯度高。 一般用该方法提取的蜈虼酸性蛋 白生药浓度可达0.484 0.580g/ml ，酸性蛋白含量可达15. 8 17. 8mg/ml。蜈蚣酸性蛋白的紫外光谱吸收峰的测定方法是精密吸取1%蛋白标准液lmL (取20%白蛋白溶液0.5ml，置10ml量瓶 中，加水至刻度，摇匀，为1%蛋白标准液)，加入双縮脲试剂4mL (称取硫 酸铜0.6g，酒石酸钾钠1.8g，碘化钾l.Og，氢氧化钠4.8g，加入200ml水，摇 匀即得)，摇匀放置10min;以重蒸水为空白，利用岛津公司的UV-240进 行，量程lcm，从500 700nm进行扫描测定。蜈蚣酸性蛋白质的含量测定对照溶液的制备取lml 1%蛋白标准液至试管，加入双缩脲试剂4ml，摇 匀，室温放置10min,待测。样品溶液的制备取lml蜈蚣蛋白提取液至试管，加入双縮脲试剂4ml， 摇匀，室温放置10min，待测。以重蒸水为空白在560mn波长处测定上述2种溶液的吸收度，按下列公式 计算。C娱讼蛋白-(A娱松蛋白一A空白)承G蛋白标准液/( A蛋白标准液-A空白)本专利技术方法提取的蜈蚣酸性蛋白，可用于制备治疗各种心脏疾病的药物， 如制备用于治疗动脉硬化、心肌性缺血等疾病的药物。除此之外，本专利技术方法 所提供的蜈蚣酸性蛋白在进一步的药理实验中还发现其在抗急性心力衰竭、抑 制心肌纤维化、抑制心肌肥厚方面具有人们意想不到的效果。由此本专利技术完成了蜈蚣酸性蛋白在制备预防心衰的药物、制备抑制心肌纤 维化及抑制心肌肥厚药物中的应用。本专利技术方法所提取的蜈蚣酸性蛋白所具有的良好药理活性，通过以下试验 (实施例1 3)得到了验证。具体实施例方式实施例1 蜈蚣酸性蛋白对急性心力衰竭大鼠心功能的影响 材料与方法1. 1试验动物纯种清洁级SD大鼠60只，体重200-240g，雌雄兼用，购自河北医科 大学实验动物中心。 1.2实验用药物蜈蚣酸性蛋白(centipede acidic protein, CAP)，采用少棘巨蜈 蚣(购自石家庄市乐仁堂药店，经河北医科大学中医学院中药系鉴定为正 品)按照本专利技术方法提取制备，其生药浓度0.484g/ml，酸性蛋白含量 15. 8mg/ml。蜈船水提取物(艮卩centipede aqueous extract, CAE),采用少棘巨 蜈蚣(购自石家庄市乐仁堂药店，经河北医科大学屮医学院中药系鉴定为正 品)实验前将蜈蚣粉碎，加水煮沸30min滤出水提取液，残渣再用水煮沸30min， 合并两煎水提取液,浓縮制成lg生药/ml的蜈蚣水提物，4'C冰箱r:存备用。注射用阿霉素(浙江海正药业股份有限公司生产，10rng/ml，批号 050803)1.3模型制备实验动物常规观察1周后随机分为4组，每组各15只。分别为空白对 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取蜈蚣酸性蛋白的方法，其特征在于它包括有以下步骤：ａ、将蜈蚣细粉，加入无水乙醇脱脂，在冰水浴中超声波振荡１５～３０分钟，过滤，留取滤渣；ｂ、取滤渣，加入磷酸盐缓冲液，在冰水浴中超声波振荡１．５～２．５小时后，在－１０～ ５℃渗漉提取１２～１４小时，渗漉液在２～４℃下用离心机离心获取上清液，上清液经纸浆滤饼过滤，留取滤液；ｃ、将滤液置于半透膜中，放在置有重蒸馏水的容器中，浓缩透析１０～１４小时，每１～２小时更换一次水；留取浓缩液；用磷酸溶液调节浓缩液 的ｐＨ值至偏酸性后，于４０℃下真空再次浓缩；ｄ、将浓缩液在０～６℃低温下缓慢加入无水乙醇至醇浓度达４０～５０％，放置１０～１４小时后，在０～４℃用离心机离心获取半固体状沉淀，该沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解后，冷藏。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋晔，王菊素，司秋菊，赵志国，楚立，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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