酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途制造技术

与得自拟诺卡氏菌属菌株的蛋白酶同源的酸－稳定性蛋白酶，它们在含有所述蛋白酶的动物饲料，饲料－添加剂和饲料组合物中的用途，以及使用所述蛋白酶处理植物蛋白质的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国申请01804707.6的分案申请，该母案于2001年2月5日以国际申请号PCT/EP01/01153提交，于2002年8月8日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的专利技术名称。
本专利技术涉及酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的(体内)用途，以及这种蛋白酶处理植物蛋白质的(体外)用途。蛋白质是动物和人必不可少的营养因子。大多数牲畜和很多人从植物蛋白质来源中摄取必需的蛋白质。重要的植物蛋白质来源是例如油料种子作物，豆类和谷类。例如，当在单胃动物，如猪和家禽的饲料中含有豆粉时，大部分豆粉固体不能被消化。例如，小猪和处于生长期的猪的表观回肠蛋白质消化能力仅为80％左右。单胃动物和多种鱼的胃表现出强酸性pH。然而，大多数的蛋白质消化发生在小肠。因此，需要一种在流经胃之后仍能存活的酸-稳定性蛋白酶。
技术介绍
从下列文献中可以了解蛋白酶在动物饲料中的用途，或其处理植物蛋白质的用途：WO95/28850公开了一种含有植酸酶和蛋白酶的动物饲料添加剂。第7页详细说明了多种蛋白酶。WO96/05739公开了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶饲料添加剂。第25页列出了适当的蛋白酶。WO95/02044公开了得自棘孢曲霉(Aspergillus aceleatus)的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。US3966971公开了通过用酸性植酸酶并任选一种蛋白酶处理，由植物蛋白质来源获取蛋白质的方法。第2栏中详细说明了适当的蛋白酶。US4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多个链霉菌属(Streptomyces)菌株的蛋白酶制品及其在动物饲料中的-->用途。然而，这些蛋白酶不是酸-稳定性的和/或不与本文所述的蛋白酶同源。专利技术简述本专利技术鉴定出的蛋白酶具有很好的酸-稳定性，有望在动物饲料中具有改良的性能。附图简述以下将参照附图进一步阐明本专利技术，其中：图1显示了5种蛋白酶(2种得自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的酸-稳定性蛋白酶，和3种参照蛋白酶(得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)〔的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASETM))在温度为37℃，pH值范围为pH2至pH11的条件下保温2小时之后的pH-稳定性曲线，即残留的蛋白酶活性；所述活性是相对于在pH9.0和5℃下保温2小时之后的残留活性而言的；图2显示了相同的5种蛋白酶在pH3至pH11的范围内的pH-活性曲线，即蛋白酶活性，所述活性是相对于最适pH时的蛋白酶活性而言的；和图3显示了相同的5种蛋白酶在15℃至80℃的范围内，pH为9.0时的温度-活性曲线，即pH为9.0时的蛋白酶活性，所述活性是相对于最适温度下的蛋白酶活性而言的。专利技术详述本文所用术语蛋白酶是水解肽键(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被称为例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。本专利技术优选使用的蛋白酶是在多肽链内部起作用的内在(endo)-型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，所述肽底物与所述蛋白酶的特异性相关。上述的蛋白酶定义中包括属于EC目录(源自NC-IUBMB的酶名称1992版，1992)EC3.4酶组(包括其13种亚-亚类的每一种)的任何酶，该目录被定期添加和更新，具体可参见环球网(www)，网址为http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。-->基于蛋白酶的催化机理将其分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)和未知的，或未被分类的蛋白酶(U)，参见蛋白酶手册，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F. Woessner(编)，Academic Press(1998)，尤其是总引言部分。本文公开的拟诺卡氏菌属蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在特定的实施方案中，本专利技术所用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。术语丝氨酸蛋白酶指的是上述手册中定义的丝氨酸肽酶及其异种集团。在1998年版的该手册中，第1-175章涉及丝氨酸肽酶及其异种集团。丝氨酸蛋白酶被定义为肽酶，其催化机理依赖于丝氨酸残基的羟基，所述羟基作为攻击肽键的亲核体起作用。本专利技术所用丝氨酸蛋白酶的例子是上述手册中定义的SA异种集团的蛋白酶，例如S2家族(streptogrisin)，如S2A亚族(α-裂解蛋白酶)。可使用任何测定法测定蛋白酶活性，所述测定法中利用了底物，底物中包括与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。类似地，使pH-试验和温度-试验适应于所述蛋白酶。pH值-试验的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。温度-试验的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如Sigma S-7388)。该pNA-底物中的大写字母指的是单字母氨基酸密码。另一个例子是Protazyme AK(由Megazyme T-PRAK制备成片剂的经天青精(azurine)染色的交联酪蛋白)。pH-活性和pH-稳定性研究优选pNA-底物，而温度-活性研究优选Protazyme AK底物。实验部分描述了蛋白酶检测法的例子。对本专利技术所用蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表现出蛋白酶活性的任何突变体，变体，片段等，以及合成的蛋白酶，如经改组的蛋白酶和共有蛋白酶。可以按照本领域公知的技术，例如通过定点诱变，PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)，或随机诱变制备经基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白质的制备描述于例如EP897985。本专利技术所用酸-稳定性蛋白酶的例子是：(i)得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262和Nocardiopsis alba的蛋白酶；(ii)与(i)中的任何蛋白酶具有至少60，65，70，75，80，85，90-->或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2中的任何一个具有至少60，65，70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶。为了计算同一性百分比，可以使用本领域已知的任何计算机程序。所述计算机程序的例子有：Cl本文档来自技高网...

【技术保护点】
至少一种酸－稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途，其中所述蛋白酶　　　　（ａ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１和／或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２，或者是其突变体、变体或片段；　　　　（ｂ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２或其片段；　　　　（ｃ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２；　　　　（ｄ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１，或者是其突变体、变体或片段；　　　　（ｅ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１或其片段；或　　　　（ｆ）与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１和／或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２具有至少７０％的同一性。

【技术特征摘要】
DK 2000-2-8 PA2000002001.至少一种酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途，其中所述蛋白酶
(a)包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2，或者是其突变体、变体
或片段；
(b)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其片段；
(c)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；
(d)包含SEQ ID NO：1，或者是其突变体、变体或片段；
(e)包含SEQ ID NO：1或其片段；或
(f)与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少70％的同一性。
2.至少一种酸-稳定性蛋白酶在制备用于动物饲料的组合物中的用途，
其中所述蛋白酶
(a)包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2，或者是其突变体、变体
或片段；
(b)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其片段；
(c)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；
(d)包含SEQ ID NO：1，或者是其突变体、变体或片段；
(e)包含SEQ ID NO：1或其片段；或
(f)与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少70％的同一性。
3.权利要求1或2的用途，其中蛋白酶的剂量是每kg饲料0.01-200mg
蛋白酶酶蛋白质。
4.改善动物饲料营养价值的方法，其中在该饲料中添加至少一种酸-
稳定性蛋白酶，且其中所述蛋白酶
(a)包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2，或者是其突变体、变体
或片段；
(b)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其片段；
(c)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；
(d)包含SEQ ID NO：1，或者是其突变体、变体或片段；
(e)包含SEQ ID NO：1或其片段；或
(f)与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少70％的同一性。
5.动物饲料添加剂，其含有
(a)至少一种酸-稳定性蛋白酶；和
(b)至少一种脂溶性维生素，和/或
(c)至少一种水溶性维生素，和/或
(d)至少一种痕量矿物质，和/或
(e)至少一种宏量矿物...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得R奥斯特加尔德，卡斯滕肖霍姆，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]