本发明专利技术公开了一种测定巯基蛋白酶酶活的方法及其专用稳定溶液，涉及酶活测定方法。本发明专利技术所提供的巯基蛋白酶的稳定溶液，含有０．０６－０．０８ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐、０．０２５－０．０５ｍｏｌ／Ｌ Ｌ－半胱氨酸、０．０５－０．１０ｍｏｌ／Ｌ普鲁兰。本发明专利技术所提供的测定巯基蛋白酶酶活的方法，包括如下步骤：用磷酸盐溶液配制酶样品，用ｐＨ６．８－７．２的２％偶氮化白蛋白溶液与酶样品溶液在３６．８－３７．２℃反应１０分钟，４３０ｎｍ下测定ＯＤ值，计算酶活；所述磷酸盐溶液含有０．０６－０．０８ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐、０．０２５－０．０５ｍｏｌ／Ｌ Ｌ－半胱氨酸、０．０５－０．１０ｍｏｌ／Ｌ普鲁兰。本发明专利技术的酶活效价的测定方法与体外血型血清学检定实验条件相一致，测定结果稳定、精确，适用于体外血型血清学检定实验使用的巯基蛋白酶试剂的酶活力测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶活力测定方法及其专用稳定溶液，特别是涉及一种巯基蛋白酶活力测定的方法及其专用稳定溶液。
技术介绍
使用巯基蛋白酶进行红细胞血型、免疫性血型抗体检定已有近60年的应用历史。木瓜蛋白酶(Papain)、菠萝蛋白酶(Bromelein)和无花果蛋白酶(Ficin)是几种常用的血型血清学使用的巯基蛋白酶。酶活力效价的标化是涉及体外血型血清实验检定质量的关键内容，国际众多学者，如R，Lsmbert(Medical Sciences 1978；35233)、PK Phillips(J ClinPathol 1988；457)、M.L.Scoott(Medical Laboratory Sciences 1988；457)等人都曾报道过血型血清学使用的巯基蛋白酶的活力效价分析方法，但这些活力效价分析方法与体外血型血清检定实验方法差距较远，如ISBT/ICSH-1994工作条约显示用M.L.Scoott等人的报道方法标化的木瓜蛋白酶试剂进行的体外血型血清学实验检定会产生“假阳性”反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种较准确地测定巯基蛋白酶活力效价的方法及其专用稳定溶液。本专利技术所提供的巯基蛋白酶的稳定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mmol/L普鲁兰。为了增加巯基蛋白酶在溶液中的稳定性，所述稳定溶液一般还含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二钾和0.2-0.3mol/L甘露醇。磷酸盐优选的是磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物，所述磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的摩尔比为20-22∶1。稳定溶液的pH为5.3-5.7。本专利技术所提供的测定巯基蛋白酶活力效价的方法，是用巯基蛋白酶、专用稳定溶液配制的酶样品，用pH6.8-7.2的1-2％偶氮化白蛋白(底物溶液)溶液与酶样品溶液在36.5-37.5℃反应10分钟，在430nm测定OD值，计算酶活力效价；所述巯基蛋白酶的稳定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普鲁兰。所述底物溶液是用偶氮化白蛋白、磷酸盐溶液配制的，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物，它们的摩尔比为1.5-2.5∶1。在上述内容的基础上，酶活力效价测定的具体步骤包括1)将浓度为30-40mg/100ml的样品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中预热10分钟；2)将底物溶液和样品溶液按体积比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反应10分钟；3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；4)离心取上清液，加入等体积的0.5mol/L氢氧化钠溶液；5)在430nm测定酶水解液OD值。本专利技术由于采用了上述技术方案，具有以下优点1、使用了较强的缓冲体系，将酶反应过程的pH控制在了7.0±0.1范围内，降低了测量不定度。2、由0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸、0.05-0.10mmol/L普鲁兰配制酶原料的样品溶液，对酶样品的激活、酶样品溶液的稳定是重要的，可以克服酶样品溶液的活力衰减，降低测量不定度。3、控制酶与底物的水解反应时间、反应温度、离子强度、pH条件等实验条件，使酶活力效价的测定条件与体外血型血清学实验检定条件保持一致，为体外血型血清学实验检定使用的巯基蛋白酶质量标准评价，以及体外血型血清学实验检定技术的评价提供了数据化保证。4提出了酶试剂溶液的活力控制标准，10-16U/50μl，或100-160U/50μl。具体实施例方式实施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取与制备取1000g的番木瓜果浆冰冻物，用微波加热融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)，在匀浆器中匀浆。加入1％壳聚糖溶液100ml，匀浆搅拌，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。向滤液中加入硫酸铵至35％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；在上清液中加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟。10000×g离心20分钟，弃去沉淀物；最后再向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，室温静置60分钟，10000×g离心20分钟，收集沉淀物。将沉淀物用200ml纯水溶解，然后用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜超滤，在超滤过程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的条件下循环超滤1h，得到超滤浓缩液。向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，混匀。用该磷酸钾缓冲液预先平衡纤维素CM-92色谱柱，然后以5ml/min的速度，将溶液上柱，以0.7mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)为洗脱液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩洗脱液。向浓缩液加入普鲁兰0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物30g。实施例2、巯基蛋白酶制剂的制备本实施例制备了木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的制剂，其中木瓜凝乳蛋白酶为实施例1所得，木瓜酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶为市售商品酶。一、木瓜凝乳蛋白酶制剂1配方普鲁兰 0.048mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol抗坏血酸钠 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜凝乳蛋白酶 200000PU2、制备工艺及过程定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制剂。二、木瓜蛋白酶制剂1配方普鲁兰 0.05mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol 抗坏血酸钠 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜蛋白酶 200000PU2、制备工艺及过程定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到木瓜蛋白酶制剂。三、菠萝蛋白酶制剂1配方普鲁兰 0.042mmol甘露醇 0.28mol海藻糖 0.02mol抗坏血酸钠 0.02molL-半胱氨酸 0.055mol菠萝蛋白酶 200000PU2、制备工艺及过程定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到菠萝蛋白酶制剂。四、无花果蛋白酶制剂1配方普鲁兰 0.04本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巯基蛋白酶的稳定溶液，含有０．０６－０．０８ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐、０．０２５－０．０５ｍｏｌ／Ｌ Ｌ－半胱氨酸和０．０５－０．１０ｍｏｌ／Ｌ普鲁兰。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢世昌，刘俊凤，
申请(专利权)人：广州伟仕科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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