筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法技术

本发明专利技术提供了筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法，该方法包括：在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步骤，和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A时，选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及以胱天蛋白酶(caspase)-14对鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的分解为指标，。
技术介绍
角质细胞由于终末分化，对有害环境形成被称为“角质层”的保护屏障、角质层细胞间隙的脂类在该保护屏障中发挥重要的作用。角质层细胞间隙的脂类，在表皮角质细胞中与分化同时生物合成，积累在角质小体中。角质 层细胞间隙的脂类的主要成分神经鞘胺醇，是通过葡糖脑苷脂酶切断由角质小体的胞吐作用释放到角质层细胞间隙中的葡糖神经鞘胺醇的糖链而生成的。此外，已知在其他途径中，由鞘磷脂酶将鞘髓磷脂分解为神经鞘胺醇。作为鞘脂类活化蛋白质的鞘脂激活蛋白(saposin)是水解鞘脂类必需的蛋白质，已知存在4种鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D)。由于鞘脂激活蛋白是作为产生角质层细胞间隙脂类必需的神经鞘胺醇合成酶(例如葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶等)的辅酶作用的因子，所以认为鞘脂激活蛋白对皮肤屏障功能而言是重要的。迄今为止，已确认鞘脂激活蛋白A、C、D如果在内脏中积累，则产生溶酶体忙积症(例如，Gaucher氏病、Niemann-Pick病)，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)基因的突变造成神经损伤性的表型。已报道了在患有与皮肤相关的特应性皮炎或牛皮癣的患者中，鞘脂激活蛋白原降低(分别参见Tezuka等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323 和 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400)。已知在各种皮肤疾病(例如特应性皮炎、牛皮癣、接触性皮炎等)中可见的皮肤粗糙症状中，水分从皮肤的丧失比健康皮肤更旺盛。所谓的水分透皮蒸发量(TEWL)的增加可以认为与承担保持皮肤内的水分或作为屏障功能的成分减少相关。迄今为止，已报道了伴随着皮肤屏障功能降低，皮肤的皮肤功能降低，其结果是出现皮肤增殖性异常的情况。特别是在高龄对象的情况下，由于恢复已降低的皮肤屏障功能花费长的时间，因而需要新型皮肤屏障功能恢复剂，所述新型皮肤屏障功能恢复剂对于阻止随年龄增加而导致皮肤的皮肤功能降低所造成的皮肤增殖性异常等有效。对所研究的包括促进皮肤屏障功能恢复的制剂等化妆品在内的物质，必须在动物实验中确认其效果。然而，近年来，在化妆品研发的实际情况中，具有出于伦理的观点限制动物实验的倾向，对不用动物而筛选候选物质的方法需求变高。现有技术文献非专利文献非专利文献l:Tezuka 等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323非专利文献2 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的课题是提供使用新型指标的恢复皮肤屏障功能的物质的筛选方法。解决课题的手段胱天蛋白酶(caspase) -14是胱天蛋白酶(caspase)家族的最新成员，主要在分化的角质细胞中表达。胱天蛋白酶-14鉴定出了胱天 蛋白酶家族成员间相同的EST。根据最近的研究显示，角质化细胞中的胱天蛋白酶-14加工变成异二聚体，之后表现出对与胱天蛋酶-I对应的合成底物Trp-Glu-His-Asp-AFC的酶的活性(MikolajczykJ.等人，Biochemistry 43，10560-9 (2004))。这一水解活性对蛋白质分解切割和亲液盐的存在是必需的。胱天蛋白酶-14的一级结构与炎性胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶(caspase) -I、_4和-5)非常相似，但胱天蛋白酶(caspase) -14仅限于分化的角质细胞中表达，提示与角质细胞终末分化中的其他形态相关(Lippens S.等人，Cell DeathDiffer. 7，1218-24(2000))。然而，尚未了解胱天蛋白酶_14的活化机制、天然底物或调节因子。在本文中，本专利技术人从分化的培养人表皮角质化细胞(NHEK )提取物中分离与胱天蛋白酶-14结合的蛋白质，进行LC/MS/MS分析，从结合胱天蛋白酶-14的蛋白质中鉴别出鞘脂激活蛋白原(prosaposin)。本专利技术人发现了鞘脂激活蛋白原在从基底层至颗粒层中表达，而鞘脂激活蛋白A在颗粒层最上层部分中表达，此外，胱天蛋白酶-14参与鞘脂激活蛋白原的加工，产生鞘脂激活蛋白的中间体和鞘脂激活蛋白A，从而完成了本专利技术。因而，本申请包括以下专利技术(I)，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步骤,和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为鞘脂激活蛋白(saposin) A时，选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。(2)在(I)中记载的方法,通过使用抗鞘脂激活蛋白(saposin) A抗体的蛋白质印迹方法评估上述分解。专利技术的效果一直以来，已知在体外实验中，胱天蛋白酶-14仅在存在高浓度的亲液盐(例如柠檬酸)的条件下表现出活化作用。因此，一直不清楚胱天蛋白酶-14在体内实现的功能。此次，本专利技术人首次明确了在不添加亲液盐的条件下胱天蛋白酶-14限定分解鞘脂激活蛋白原，产生鞘脂激活蛋白的中间体和鞘脂激活蛋白A(图I)。本专利技术人通过免疫染色进一步明确了鞘脂激活蛋白原(prosaposin)在从基底层至颗粒层中表达，此外，鞘脂激活蛋白A存在于皮肤的颗粒层上部(图2)。根据以上结果，认为胱天蛋白酶-14在生物体内有利于鞘脂激活蛋白原的加工。鞘脂激活蛋白原的分解产物鞘脂激活蛋白作为生成角质层间隙的脂类所必需的神经鞘胺醇合成酶的辅助因子发挥作用，是形成表皮屏障所必需的，根据本专利技术的方法，以胱天蛋白酶-14分解成鞘脂激活蛋白A为指标，可以不进行动物实验，而研究新型的促进皮肤屏障功能恢复的物质。附图说明图I :在存在或不存在胱天蛋白酶(caspase) -14的条件下，显示鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工的示意图。图2 :显示人正常皮肤中的鞘脂激活蛋白原(prosaposin)和鞘脂激活蛋白A的局部分布的免疫染色图。具体实施方式 本专利技术提供了，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步骤，和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为鞘脂激活蛋白(saposin) A时,选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。本专利技术方法中使用的候选物没有限制，可以考虑例如活化胱天蛋白酶(caspase) -14,由此促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解的物质。胱天蛋白酶-14是半胱氨酸蛋白酶，因此，还原剂或具有还原作用的物质，例如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等试剂、谷胱甘肽等生物体内的物质、具有还原作用的植物提取液可以成为该候选物。在存在该候选物的条件下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原，当与对照相比显著促进鞘脂激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：日比野利彦，山本真实，
申请(专利权)人：株式会社资生堂，
类型：
国别省市：