试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及包含DNA依赖性DNA聚合酶和至少一种天然的脱氧核苷的试剂盒，并涉及包含DNA依赖性DNA聚合酶和检测系统的试剂盒，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够被置换出或能够结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA。其还涉及用于测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的方法，其特征在于；(i)使样品在容器中与反应混合物接触，所述反应混合物包含DNA依赖性DNA聚合酶、至少一种脱氧核糖核苷和检测系统，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够掺入所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA、从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置换出或结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA；(ii)孵育所述容器；(iii)测量来自所述荧光部分的信号；和使来自所述荧光部分的信号与所述样品中的脱氧核糖核苷激酶活性相关联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】试剂盒和方法
本专利技术涉及实时地均质(即非固相)测定样品中的一或几种脱氧核糖核苷激酶的试剂盒和方法，其用于诊断疾病、失调、感染(病毒性和细菌性)或癌症。专利技术背景脱氧核糖核苷激酶真核细胞中存在至少三种脱氧核糖核苷激酶，胸苷激酶1和2(TK1和TK2)、脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)。存在着编码两种不同胸苷激酶的两种人类基因座。可以在细胞的胞浆中发现胸苷激酶。胸苷激酶2定位于线粒体并参与线粒体DNA合成。TK2具有与胸苷激酶1不同的氨基酸序列、底物特异性和表达谱。从细胞周期的G1期末期开始和贯穿S期，胸苷激酶1的活性最为明显。TK和dCK负责通过补救途径调节细胞中的TTP和dCTP池。所述TK酶在三磷酸腺苷(ATP)的存在下催化胸苷向单磷酸胸苷(TMP)转化。在整个细胞周期都发现脱氧胞苷激酶的活性，并且主要在淋巴来源的细胞中鉴定到其活性。TK2定位于线粒体中并与dCK具有对dC几乎相等的亲和力。疾病的诊断在20世纪80年代早期，表明胸苷激酶活性不仅可以从受各种肿瘤疾病影响的患者的血清中检测到，而且与健康人类个体(其中通常表现出非常低的TK活性)有广泛的差异。目前广泛接受使用TK作为血液癌症疾病诊断和预后的单一肿瘤标记物。在某些情况下，TK已显示出直接的诊断能力。TK和其他脱氧核糖核苷激酶的活性早已与疾病相关联，这由Eriksso等人(2002)和由Topolcan与Holubec(2008)在综述中有所总结。已将TK2和线粒体疾病相联系。检测脱氧核糖核苷激酶的测定放射性底物，如3H-胸苷，已被广泛用于在过滤结合测定中确定TK和dCK的活性。对于常规的临床诊断，基于放射性的测定不是个有吸引力的选择。在最近几年中，已作过几种尝试以开发不基于放射性的测定，所有这些测定在一个方面或其他方面更好。以下是在不同的脱氧核糖核苷激酶的检测中所使用的一组方法、测定和试剂组合物。在EP1385005中，提出基于叠氮胸苷(AZT)的竞争性单磷酸化的不基于放射性的TK活性测定。这项技术已由DiasorinS.r.l.进一步开发成自动的两步骤的发光诊断测定。在该两步的测定中，首先由样品中存在的TK将AZT磷酸化为单磷酸化的AZTMP。接着从缀合至异氨基苯二酰肼(AZTMPABEI)的AZTMP检测发光，所述缀合至异氨基苯二酰肼的AZTMP与固体表面底物上的TK磷酸化AZTMP竞争结合抗AZTMP抗体。该两步骤测定的主要缺点是动态读取受限。另一缺点是使用修饰的核苷底物代替天然的胸苷。在WO2009/063254中公开了通过使用单磷酸化的Br-dU的用于确定样品中TK活性的半均质方法，所述单磷酸化的Br-dU通过HPLC分离并通过UV检测。该方法的缺点是用修饰的底物进行所述反应和以分离步骤进行检测。US2008/248472公开了固相测定，其通过试剂混合物中的脱氧核糖核苷激酶互补样品中TK活性以产生Br-dUTP(天然TTP的衍生物)。随后使用RNA依赖的DNA聚合酶通过引物延伸掺入所述Br-dUTP。固相结合的RNA模板由单体rA建成，长200-400个单体，并被连至固相。在ELISA中使用碱性磷酸酶缀合的抗[Br]dU抗体在第二步骤检测掺入的[Br]U来最终确定TK活性。用许多手动交互步骤进行这个两步骤的测定是繁琐的并且执行所述测定花费过长的时间。尚未提出用于测量样品中dCK活性的可靠的检测。附图简述图1显示了产生TTP和dCTP的补救途径图2显示了根据本专利技术的方法的检测系统2的原理图3显示了根据本专利技术的方法的检测系统3的原理图4显示了根据本专利技术的方法的检测系统1的原理图5通过实时荧光捕获获得的荧光曲线获得实施例3的hrTK1标准点的阈值水平Ct。图6实施例3的hrTK1标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图7实施例4的hrdCK标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图8实施例7多重hrTK1与hrdCK在对数标度上的线性回归。图9犬血清样品中的TK1测量和实施例8中使用的hrTK1标准点在对数标度上的线性回归。图10通过实时荧光捕获获得的线性归一化的荧光曲线获得实施例9的阈值水平Ct。图11实施例9的致病性犬血清和hrTK1标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图12通过实时荧光捕获获得的线性和动态管归一化的荧光获得实施例10的阈值水平Ct。图13实施例10的hrTK1标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。定义：本说明书中的所有术语和词语应当按照其正常含义和在相关领域中的使用来解释。为了明确起见，以下更具体地讨论一些术语。除非另有说明，在整个专利技术中互换地使用胸苷和脱氧胸苷。均质测定是非固相测定，其在延伸引物-模板系统时产生信号，需要最少的引物延伸后操作。这些测定无需分离步骤。所述反应完全在溶液中发生，没有珠或固相附着干扰低亲和力的相互作用。均质测定方法对药物发现中所需的通量和测定小型化是必要的。在任何均质测定中，在测量过程中存在所述测定的所有组分。排除分离步骤是这些测定方法的主要优点，但由于测定成分的非特异性测量这也存在困难(来源：http://www.genomicglossaries.com/content/Assays.asp,2010年4月28日检索)。脱氧核糖核苷是包括连接至五碳糖脱氧核糖的含氮碱基的分子。脱氧核糖核苷通常被简单地称为结合至脱氧核糖的碱基。天然的脱氧核糖核苷被定义为未修饰的脱氧核糖核苷。这些的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。天然的脱氧核糖核苷是在野生型活生物体(如人类)中存在的形式的脱氧核糖核苷。修饰的脱氧核糖核苷也称为核苷类似物，是在葡基胺或核酸碱基(nucleobase)上有任何种类修饰的脱氧核糖核苷。在医药中，几种核苷类似物用作抗病毒剂或抗癌剂。修饰的脱氧核糖核苷的实例是叠氮胸苷(AZT)、溴-脱氧尿苷(Br-dU)、碘-脱氧尿苷、乙烯基-脱氧胸苷和氟-脱氧尿苷。DNA依赖性DNA聚合酶是催化脱氧核糖核苷三磷酸以单链DNA为模板组装为脱氧核糖核酸的酶。在一些文献中，DNA依赖性DNA聚合酶也可称为DNA指导的DNA聚合酶。DNA依赖性DNA聚合酶可以具有三种不同的酶活性：(a)5'至3'聚合酶活性，在模板DNA指导下催化由脱氧核糖核苷5'-三磷酸产生的单核苷酸单元添加至引物链的3'-羟基末端；(b)仅在双链体DNA上的5'至3'核酸外切酶的活性；(c)主要在单链DNA上有活性的3'至5'核酸外切酶，其可以选择性地去除不匹配的末端核苷酸。注意除DNA聚合酶I外，TaqDNA聚合酶和来自Thermusthermofilus的Tth聚合酶是至今鉴定的仅有的具有5'→3'核酸外切酶活性的DNA依赖性聚合酶。DNA模板分子是作为DNA依赖性DNA聚合酶的模板的ssDNA分子。DNA引物分子是短的DNA分子，其与DNA模板分子的区段互补并作为DNA依赖性DNA聚合酶的DNA聚合的引物。完整的形式：当本专利技术中所使用的DNA探针是根据本专利技术进行的任何聚合酶反应之前的形式时，称其为完整的形式。补救合成途径示于图1，是合成TTP和dCTP的途径之一。TTP和dCTP是胸苷和脱氧胞苷的相应的脱氧核糖核苷三磷酸。这些首先通过在脱氧核糖核苷激酶的帮助下从例如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.14 SE 1050473-61.包含具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA依赖性DNA聚合酶和至少一种天然的脱氧核糖核苷的试剂盒，其中所述至少一种天然的脱氧核糖核苷选自脱氧胸苷和/或脱氧胞苷或其混合物。2.包含DNA依赖性DNA聚合酶、至少一种天然的脱氧核糖核苷和检测系统的试剂盒，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置换出或结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA。3.权利要求1或2的试剂盒，还包含至少一种磷酸转移酶。4.权利要求1或2的试剂盒，还包括至少一种修饰的脱氧核糖核苷。5.权利要求2的试剂盒，其中所述荧光部分偶联至单链DNA探针。6.权利要求5的试剂盒，其中所述荧光部分和一猝灭部分偶联至单链DNA探针。7.权利要求2的试剂盒，其中所述荧光部分是双链DNA表面结合或嵌入分子。8.权利要求2的试剂盒，其中所述荧光部分是Eva染料或GreenI。9.权利要求5的试剂盒，其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分在所述探针处于其完整形式时是猝灭的。10.具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA依赖性DNA聚合酶和至少一种天然的脱氧核糖核苷在制备用于通过以下方法测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的试剂盒中的用途，其中所述至少一种天然的脱氧核糖核苷选自脱氧胸苷和/或脱氧胞苷或其混合物，所述方法包括：a.使样品在容器中与反应混合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·斯托尔汉德斯克，J·伦纳斯特兰德，
申请(专利权)人：P·斯托尔汉德斯克，J·伦纳斯特兰德，
类型：
国别省市：