本发明专利技术涉及一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)抑制剂的方法。通过采用柱前衍生-高效液相色谱法检测底物的转化量来评价所添加的植物提取物对DXS酶的磷酸丙糖异构化活性的抑制作用。主要涉及到：将植物提取物加入到DXS酶催化的磷酸丙糖异构化反应体系中，在一定温度下反应后，以磷酸酶水解反应体系中的磷酸丙糖，再加入2，4-二硝基苯肼进行衍生化，然后以高效液相色谱法利用甲醇-水或乙腈-水为流动相梯度，紫外检测仪检测。本方法在筛选过程中，所用底物D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)均不含同位素标记；筛选过程简单、快速、可行性强，不需要用昂贵的大型仪器检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶抑制剂的筛选领域，具体涉及一种从植物提取物中筛选I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)抑制剂的简便方法。
技术介绍
萜类化合物又称类异戊二烯，是生物体内广泛存在的一类天然烃类化合物，它们在生物体中发挥着重要的作用，如植物甾醇参与生物膜的构建；泛醌参与呼吸作用；类胡萝卜素及叶绿素的侧链和质体醌参与光合作用；雌激素参与细胞间信号传递过程并可控制个体的生长发育；多萜醇和异戊二烯基团参与蛋白修饰；甜椒醇(capsidiol)等可作为抗菌素及植物抗毒素用于物种间相互防御；赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和油菜素内酯调节植物生长发育；维生素A的存在可促进视网膜的正常功能，缺乏则导致夜盲症；维生素D能促·进钙、磷在肠内的吸收，维持血钙血磷的平衡，促进骨质的钙化等。同时，植物中所含的其它一些萜类化合物在调节植物与环境的关系上发挥重要的生态功能，如防御食草动物和病原微生物，吸引传粉动物和播种动物，作为中间感应化合物参与中间竞争等。萜类物质还具有抗氧化活性，在人体中可起着延缓衰老和增强免疫力的作用，其中不少萜类化合物还具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分，如目前广泛使用的抗疟药物青蒿素、抗心血管疾病的银杏内酯及具有很强抗癌活性的化合物紫杉醇等。长期以来，生物体内的萜类化合物被认为是由乙酰辅酶A经甲羟戊酸(MVA)而合成，并认为MVA是萜类化合物生物合成的唯一前体，故该生物合成途径被称为MVA途径。但到上世纪九十年代初，人们发现萜类化合物的生物合成除MVA途径外，还存在一条非甲羟戊酸途径，由于I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是这一新途径中的两个重要中间体，故称为DXP/MEP途径,现称为MEP途径。最新研究证明，动物(包括人类)主要通过经典的MVA途径来合成其所需的萜类化合物，而人类的一些主要致病菌及原虫，则是利用MEP途径来合成其所必需的萜类化合物，这种途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的MVA途径。由于该途径合成的类异戊二烯及其衍生物在微生物的代谢过程及其细胞壁合成中至关重要，抑制或切断该途径即可达到抑菌或杀菌的目的，这就为人们提供了一个利用MEP途径中的酶为靶标进行新抗菌活性化合物筛选的强有力的方法，而使用该方法进行筛选的最大优点在于筛选的过程不需考虑选择性。因此，这条新发现的MEP途径在新类型抗菌素的发现方面将具有非常广阔的应用前景，尤其是在当前病菌对现存的各种抗菌素的耐受性日益提高的情况下。目前，对该生物合成途径中的酶及它们的作用机理的研究已成为一个热点，由于I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)是MEP途径中的第一个酶，也是该途径的第一个关键调控位点，所以对其的研究也倍受重视。Zenk,Bacher等人(US2009199313等)曾对MEP途径中酶的抑制剂筛选方法进行了尝试，但是他们所建立的方法使用的底物都是含有同位素标记的化合物，通过测定产物的生成情况来判断抑制大小，所采用的检测方法包括放射性测定法及核磁共振法等，而使用及测定具有放射性的物质时要求有单独的放射性物质操作室及专门的测定仪器，核磁共振法更是需要昂贵的核磁共振仪，这都使得这些方法不适合于在普通实验室开展相关的研究工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单快速的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，该方法适用于在实验室中以常见的反相高效液相色谱法这种检测手段，从植物提取物中筛选DXS酶的抑制剂，解决了
技术介绍
中筛选DXS酶抑制剂的方法中需要大型昂贵的仪器，如核磁共振仪等，或需要进行放射性检测等技术问题。本专利技术的解决方案的原理是=D-GAP在DXS酶的催化作用下异构化为DHAP，D-GAP及其异构化产物DHAP经磷酸酶水解后所生成的D-甘油醛(D-GA)和1，3_二羟基丙酮(DHA)都含有羰基，含有羰基的化合物可与2，4- 二硝基苯肼(2，4-DNPH)发生衍生化反应，分别生成D-GA-腙和DHA-腙，利用HPLC分离并紫外检测此二化合物，然后从检测结果判断所添加 植物提取物是否具有DXS酶抑制活性。过程如下权利要求1.一种从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于该方法包括以下环节 (1)建立筛选反应体系 采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)加入到缓冲液中，再加入所要检测的植物提取物样品，在25-45°C下孵育；所述二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+ ;然后加入磷酸酶，在30-45°C下孵肓，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化； (2)按照以上环节(I)建立对照反应体系 采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和DXS酶加入到缓冲液中，在25-45°C下孵育；所述二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+ ；然后加入磷酸酶，在30-45°C下孵育，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化； (3)反相高效液相色谱检测 以环节⑵的对照样为参比，用HPLC方法检测环节(I)的样品中D-GAP或DHAP的转化情况 采用的底物为D-GAP，则根据底物D-GAP的转化量或产物DHAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响；或者，采用的底物为DHAP，则根据底物DHAP的转化量或产物D-GAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响； 进而筛选出DXS酶的有效抑制剂。2.根据权利要求I所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于 在环节⑴和(2)，加入的底物D-GAP或DHAP的浓度为2-10mM，二价金属阳离子的浓度为 5-20mM，DXS 酶用量为 O. 2_2mg/ml，所用缓冲液为 40_400mM、pH = 5. 0-9. O 的 Tris-HCl或PBS或柠檬酸或MOPS缓冲液；水解磷酸酯过程中加入的磷酸酶的用量为O. 5-2units/μ 1，30-45°C下孵育时间为l-4h ； 在环节(I)的筛选反应体系中，样品的终浓度为l-100yg/ml，25-45°C下孵肓时间为l-8h。3.根据权利要求2所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于环节(I)和(2)的反应体系中，衍生化时加入的色谱纯试剂为甲醇，衍生化试剂为2，4_ 二硝基苯肼(2，4-DNPH)或3，5_ 二氨基苯甲酸(3，5-DABA)，浓度为50_120mM，孵肓温度为20-40°C，孵肓时间为O. 5-2h。4.根据权利要求3所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于环节(3)的检测体系中，高效液相色谱法所使用的仪器为Agilent Technologiesl200系列或岛津高效液相色谱仪，色谱柱为4. 6 X 250_ C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为1-50 μ I ;流速为O. 3-2. Oml/min ;检测波长为240_400nm ;柱温为20_40°C;流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为15-30min。5.根据本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：该方法包括以下环节：(1)建立筛选反应体系：采用D？甘油醛3？磷酸(D？GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和1？脱氧？D？木酮糖5？磷酸合酶(DXS酶)加入到缓冲液中，再加入所要检测的植物提取物样品，在25？45℃下孵育；所述二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+；然后加入磷酸酶，在30？45℃下孵肓，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化；(2)按照以上环节(1)建立对照反应体系：采用D？甘油醛3？磷酸(D？GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和DXS酶加入到缓冲液中，在25？45℃下孵育；所述二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+；然后加入磷酸酶，在30？45℃下孵育，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化；(3)反相高效液相色谱检测以环节(2)的对照样为参比，用HPLC方法检测环节(1)的样品中D？GAP或DHAP的转化情况：采用的底物为D？GAP，则根据底物D？GAP的转化量或产物DHAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响；或者，采用的底物为DHAP，则根据底物DHAP的转化量或产物D？GAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响；进而筛选出DXS酶的有效抑制剂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高文运，李恒，李瑾，胡玥，秦巍，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：
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