本发明专利技术涉及一种染色体易位干细胞模型及动物模型制备方法，主要通过CRISPR/Cas9技术诱导干细胞中特异位点染色体易位发生及细胞模型制备，以及进一步利用胚胎干细胞技术构建携带特异位点染色体易位的动物模型的方法。具体的，通过向干细胞中同时导入Cas9和针对两个目的染色体位点的gRNA，可以人工诱导特异位点的染色体易位，再经过筛选，可以得到携带该染色体易位的细胞模型。而携带该染色体易位的动物胚胎干细胞，还可以进一步通过嵌合体技术得到携带特异位点的染色体易位的动物模型。对于研究染色体易位，融合基因的功能，染色体相互作用的研究，以及药物的筛选评价，都有较大应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及在干细胞中通过CRISPR-Cas9技术构建特异 位点染色体易位，以及用干细胞构建特异位点染色体易位的动物模型的方法。
技术介绍
染色体易位（Chromosome Translocation)，即染色体片段位置的改变，是最常 见的染色体异常（参见文献：Braude, P·，Pickering, S·，Flinter, F·，and Ogilvie, C. M. (2〇〇2)· Preimplantation genetic diagnosis. Nat Rev Genet 3, Ml-%3)。其产生过 程往往是不同染色体位点的DNA双链发生断裂（double-strand breaks，DSBs)，然后不同 的染色体断端经由非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ)机制修复，造成 染色体片段位置的改变（参见文献：Roukos, V. ,and Misteli，T. (2014).The biogenesis of chromosome translocations. Nat Cell Biol 16,293-300·)。染色体易位可发生在不 同的染色体之间，也可发生于同一染色体的不同位置，使得基因的位置发生改变，往往产生 基因的突变和融合基因。 染色体易位事件可能发生在细胞减数分裂时期，使得生殖细胞携带易位染色体， 进而传到后代个体的每个细胞，包括后代个体的生殖细胞，并可能进一步遗传下去。染色体 易位事件也可能发生在细胞有丝分裂时期，使得个体的部分细胞携带易位染色体。 由于染色体易位发生的位置千差万别，因此对个体健康的影响也有很大的差 异。很多携带平衡染色体易位的个体往往表现正常，但很多染色体易位也能导致疾病， 比如不孕不育（参见文献：Fraccaro, M.，Maraschio, P.，Pasquali, F.，Tiepolo, L.，Z uffardi, 0. , and Giarola, A. (1973). Male infertility and 13-Htrans Io cat ion. Lancet I, 488)，唐氏综合症（参见文献：Prasher, V. P. (1993) · Presenile dementia associated with unbalanced Robertsonian translocation form of Down's syndrome. Lancet 342, 686-687)，精神分裂症，以及多种肿瘤（参见文献：Bunting, S. F.，and Nussenzweig,A. (2013). End-joining,translocations and cancer. Nat Rev Cancer 13,443-454)。而且也由于染色体易位发生的位置千差万别，不断有新的染色体易位被发 现，并伴有不同的临床症状（参见文献：Imataka, G·，Okuya, M·，Hirao, J·，and Arisaka, 0· (2014). Terminal deletion 6q syndrome with Ilq partial trisomy mosaicism due to maternal balanced translocation. Genet Couns 25,63-67)。因此，对染色体易位的研宄 有重要的意义。然而，由于技术的限制，一直没有容易的方法建立染色体易位的细胞或者动 物模型，用于染色体易位的研宄以及药物的筛选等应用。 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs)是分离于小鼠胚胎囊 胚期内细胞团的特殊干细胞，其明显的优势和独特的特点是可以分化为小鼠个体的一切细 胞类型，并具有无限增殖并维持其多能性的能力。因此 mESCs被广泛用于各种细胞模型的 建立，也可以定向分化mESCs得到研宄者感兴趣的细胞，比如某些难以分离，原代培养的细 胞，尤其是要经过筛选得到基因修改或基因敲除的细胞，而该类型细胞又没有很好的分裂 能力时，利用mESCs进行基因修改和筛选，再诱导其分化为该类型细胞就成了几乎唯一的 选择。mESCs还被广泛用于各种基因敲除小鼠和基因修饰小鼠动物模型的建立（参见文 献：Ben-David, U.，0· Kopper, and N. Benvenisty. (2012). Expanding the boundaries of embryonic stem cells. Cell Stem Cell 10 (6)，666-77)。如果我们能在胚胎干细胞中人 工介导任意两染色体位点的染色体易位，那么上文中一直没有容易的方法建立染色体易位 的细胞或者动物模型的问题就迎刃而解了。 CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic rep eat (CRISPR) -CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技术是近年出现的革命性的 基因编辑技术。该技术可以快速，容易的实现对目标DNA序列在精确的位点进行编辑， 包括突变，修改，插入等改变，使得生命的遗传密码可以按照人类的意愿改变。（参见文 献:Hsu, P. D. , Lander, E. S. , and Zhang, F. (2014). Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering. Cell 157,1262-1278)。该技术主要是通过向细 胞内导入引导核糖核酸（Single-guide RNA，gRNAs)和Cas9蛋白实现对目标DNA的切 害J。gRNA是一个经过特殊设计的向导RNA，可以识别并结合靶基因 DNA序列；Cas9蛋白 是一个酶，其带有一个核定位信号，以确保在哺乳动物细胞的核中表达；可以与gRNA以及 其识别的DNA结合，将目的DNA序列切断，在设计的位置上精准的介导DNA序列的DSBs， 再利用细胞DNA的损伤修复机制以及同源重组等机制，对DNA在断裂位点及附近进行突 变，插入，替换等等修改，实现基因编辑的目的（参见文献：Mali，P.，Yang，L.，Esvelt，K. Μ. , Aach, J. , Guell, Μ. , DiCarlo, J. Ε. , Norville, J. Ε. , and Church, G. Μ. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826)〇 中国专利申请CN201310625372. 9,专利技术名称为"一种玉米基因组定点改造方法"， 中国专利申请CN 201410438927. 3,专利技术名称为"白化病模型猪的重构卵及其构建 方法和模型猪的构建方法"，公开号为CN 104263754A，公开了一种白化病模型猪的重构卵 的构建方法，是通过CRISPR/Cas9技术将gRNA和Cas9的表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在干细胞中通过CRISPR‑Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：A、确定想要诱导的染色体易位的两个染色体位点，标记为chr‑site1、chr‑site2；根据目标染色体位点chr‑site1、chr‑site2分别设计gRNA的识别序列，标记为gRNA‑1、gRNA‑2；B、构建表达gRNA‑1、gRNA‑2的表达载体；C、将步骤B得到的表达gRNA‑1、gRNA‑2的表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染目标干细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘厚奇，蒋俊锋，应其龙，王越，张莉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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