一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒及其应用。本发明专利技术优选miR‑126基因上下游CRISPR‑Cas9靶标序列，设计合成针对该靶标序列的sgRNA单链，并构建到载体中，通过转染293T细胞株，sgRNA与trRNA构成特异识别结构，从而引导Cas9酶特异剪切miR‑126基因两端对应序列，持续药筛得到miR‑126全长基因敲除细胞株；经对药筛细胞株测序验证，得到优选的上下游sgRNA组合，该组合的敲除效率高达90％以上，以此构建试剂盒，可对293T、肺癌细胞系A549以及血管内皮细胞HUVEC系等多种类型细胞系进行特异性的miR‑126全长基因敲除。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种miR-126基因敲除试剂盒，特别涉及一种基于CRISPR-Cas9技术可以对miR-126全长基因序列进行特异性完全敲除的试剂盒。此外，本专利技术还公开了该试剂盒的应用。
技术介绍
microRNA(微RNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个microRNA可以有多个靶基因，而几个microRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个microRNA的组合来精细调控某个基因的表达，因此microRNA的基因功能探索和应用开发一直是研究热点。miR-126(microRNA126，微RNA126)位于人类染色体9q34.3的类表皮生长因子域7(epidermalgrowthfactorlike7，EFGL7)基因的内含子中。miR-126是一种血管内皮细胞特异性表达的microRNA，高度表达于血管形成丰富的组织，如心脏、肺脏、肾脏中。它能够通过调控Spred-1(Sprouty-related,EVH1domain-containingprotein1，Sprouty相关含EVH1区域蛋白1)、VCAM-1(Vascularcelladhesionprotein1，血管细胞粘附分子-1)、HoxA9(homeoboxA9，同源盒基因A9)、v-Crk(SarcomaVirusCT10regulatorofkinase，肉瘤病毒CT10调节激酶)、EGFL-7和VEGF(vascularendothelialgrowthfactor，血管内皮生长因子)等基因的表达参与调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等血管的生理和病理生理过程。经其他研究发现，miR-126在胃肠道，生殖道癌症，乳腺、甲状腺、肺、以及其他一些癌症中表达被抑制。下调miR-126后可诱导癌细胞增殖，迁移，侵袭以及影响细胞存活期，miR-126下调与多种癌症生存不良之间存在相关性。这些研究发现为胃肠道，生殖道癌症，乳腺、甲状腺、肺等癌症转移预防判断提供了潜在的靶标，并为胃肠道，生殖道癌症，乳腺、甲状腺、肺等癌症的生物治疗指明新方向，提示miR-126研究的重要性和必要性。由于microRNA序列较短且其前体具有茎环结构，经典的RNA干扰(RNAi)的方法不适用于microRNA下调表达的功能研究。目前microRNA研究常用的方法，是应用生物学技术在体内细胞模型或体外动/植物模型中，将microRNA进行序列封闭或者造成基因缺失突变，模拟microRNA功能缺失引起的负向调节作用弱化或撤除，进而研究其功能作用机理，技术方法主要有两类：第一类方法是设计合成microRNA的互补封闭序列，互补序列与microRNA原来特定结合的mRNA形成竞争，弱化microRNA对特定mRNA结合能力和调控作用。由于互补序列是以碱基互补的形式对microRNA进行封闭，并不直接导致microRNA降解或表达的下调，所以microRNA的表达水平不发生变化，且没有直接的技术方法可以对microRNA功能的封闭效率进行量化检测，不能直接证明microRNA的功能受到了屏蔽，只能通过检测microRNA可能的调控下游基因变化来间接说明microRNA的功能受到抑制，因而此方法对microRNA功能研究的真实性和有效性存在较大的影响。第二类方法是用转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)TALEN技术，通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，可以对microRNA进行DNA水平的剪切和修饰，模拟microRNA的功能缺失。但TALEN技术对目标基因的敲除依赖DNA结合的氨基酸聚合体模块序列，单个的TALEN模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，十分繁琐，若所有工作在实验室内部完成基本实验操作需要耗时2个月以上，若筛选稳定敲除基因的细胞系需4个月以上，整个过程耗时长，成本高。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/cas，成簇的、规律间隔的短回文重复序列)技术又称为CRISPR/Cas9(CRISPRassociatedprotein9，CRISPR相关蛋白9)核酸酶技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与上述介绍的基因技术工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。CRISPR/Cas9最早是在细菌的天然免疫系统内发现，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA，是细菌和古细菌的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA，CRISPR衍生RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA，反式激活RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9核酸酶蛋白在crRNA引导序列的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行剪切或修饰的目的。为了实现在哺乳动物中应用CRISPR/Cas9系统，科学家对CRISPR/Cas9进行改造，将tracrRNA/crRNA二元复合体融合表达形成一条单链的导向RNA。而在实际设计中，只设计合成识别靶序列的一段20nt(碱基)左右的RNA序列并称之sgRNA(smallguideRNA，小向导RNA)，其他部分导向RNA因为序列不变而作为sgRNA表达载体上的载体序列存在。因此，广泛应用的CRISPR/Cas9系统变为由含sgRNA的导向RNA指导下的Cas9核酸酶对靶向基因进行定向编辑的技术。CRISPR/Cas9技术的定点剪切编辑技术最常用的是针对单个位点设计sgRNA引导Cas9在靶标序列上进行定向剪切(例如，中国专利技术专利申请CN105112445A公开的“一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒”)，切割后细胞内固有的非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程，会引入随机插入和删除的基因突变，这个修复过程不受人为控制，导致各类不必要的和不准确的序列插入和删除，经常产生不明确或无效的细胞表型，对研究产生不利影响。目前，尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统特异性地将miR-126的全长基因序列进行敲除的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对miR-126基因进行基因敲除的试剂盒，其使得CRISPR/Cas9可以对靶标miR-126基因编码序列两端同时进行定点的剪切，能极大地避免采用传统的针对单个位点设计sgRNA引导Cas9在靶标序列上进行定向剪切所导致的非同源末端连接途径NHEJ引入随机突变发生的可能性，非常有利于产生针对于该基因完全删除的单一且明显的细胞表型，该试剂盒能高效、快速、精确、稳定地实现miR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA1和质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA3组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA1，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.2所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA3，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.4所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；或者，该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA2和质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA5组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA2，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.3所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA5，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.6所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列。...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA1和质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA1，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQIDNO.2所示的miR-126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR-126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQIDNO.4所示的miR-126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR-126基因对应序列；或者，该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA2和质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA5组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA2，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQIDNO.3所示的miR-126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR-126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA5，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQIDNO.6所示的miR-126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR-126基因对应序列。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA1含有的互补DNA序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3含有的互补DNA序列为SEQIDNO.11和SEQIDNO.12。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA2含有的互补DNA序列为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA5含有的互补DNA序列为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA1和质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3组成的sgRNA质粒组合，所述质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA2和质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA5组成的sgRNA质粒组合是用包括如下步骤的方法构建的：步骤一，通过对靶标软件设计优选一定数量的miR-126基因上游和下游CRISPR-Cas9靶标序列，具体如下：上游：sgRNA-1：TAATGTCCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓晶，赵莹，孙冰玉，姚琴琴，陆凌佳，
申请(专利权)人：上海伯豪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31